植物激素是小分子天然產物,在低濃度時就能夠調節植物的生長和發育。精確測定植物激素的含量,對深入研究其在生物合成、運輸、代謝和分子調節機制中的作用日益重要。由于植物基質復雜,植物體中植物激素的含量極低,植物樣品的前處理方法仍是制約痕量植物激素分析的一個技術瓶頸,并影響植物學研究。因此,發展高效的樣品前處理技術,結合分離檢測技術,建立高選擇性、高靈敏度、高可靠性的植物激素定性定量分析方法,是推動植物學機理深入研究的關鍵。 目前,植物激素的分析通常采用繁瑣的樣品前處理方法,一般包含過夜浸提、溶劑萃取、固相萃取凈化或色譜凈化、制備液相色譜純化等多個步驟,方法萃取效率較低,耗時長(一般需要數天)。鑒于此,本論文致力于發展新型樣品前處理方法,結合色譜-質譜聯用技術,實現植物樣品中赤霉素、油菜素甾醇和細胞分裂素等重要植物激素的高靈敏、高選擇分析,取得的主要研究成果如下： (1)將基質固相分散(Matrix Solid-Phase Dispersion, MSPD)萃取用于擬南芥中赤霉素的選擇提取,并將其與液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)聯用,建立了三種赤霉素(GA1,GA3,GA4)的定量分析方法。通過對樣品前處理條件、色譜分離條件和質譜檢測條件的優化,檢測靈敏度達到1.1-4.1n∥g。用于三份擬南芥實際樣品,檢測出其中GA1, GA3和GA4的含量分別為11.20-15.14ng/g,1.15-1.53ng/g,2.08-3.43ng/g。方法具有操作簡單、選擇性好、回收率高等優點。 (2)采用預裝填固相萃取分散劑的方式,結合靜態平衡萃取對基質固相分散萃取進行改進,并用于水稻樣品中的痕量赤霉素的選擇性提取。通過對靜態平衡時間,樣品與分散劑比例,分散劑材料以及洗脫溶劑的優化,減少了基質效應,獲得了更高的提取效率。將其與LC-MS/MS聯用分離分析八種赤霉素,檢測限達到0.03～0.67ng/g。八種赤霉素在低添加濃度下回收率為46.6%～117.9%,RSD值在39.3%以下；在較高添加濃度下,赤霉素的回收率分別在69.3%-122.5%(25ng/g)和85.7%-119.0%(35ng/g),其RSD分別小于11.3%和4.6%。結果表明,預裝填分散劑和靜態平衡萃取能有效提高MSPD過程對痕量赤霉素的萃取效率,降低基質效應,是提高檢測靈敏度的有效手段。 (3)建立了一種串聯MSPD-MAX-MCX樣品前處理方法,對植物中痕量油菜素甾醇(Brassinosteroid, BRs)進行選擇性提取和純化。MSPD采用反相分散劑,能有效去除植物基質中的中性和疏水性干擾物；隨后的串聯SPE過程能有效去除基質中的可離子化的干擾物,進而降低對質譜檢測的影響。由于MSPD和MAX-MCX過程采用同一種洗脫劑,因此,可以將兩者串聯實現提取純化一步完成。該前處理方法完全避免了植物組織過夜溶劑浸提的步驟,將樣品前處理時間由傳統的數天縮短至幾小時。在此基礎上,結合LC-MS/MS分離檢測技術,建立了一種亞克級植物樣品中痕量內源BRs (24-epiBL,24-epiCS, DS, d-epiCS, TE和TY)的高靈敏定量分析方法。對六種內源BRs的檢測靈敏度達到0.008-0.04ng/mL,單次進樣的BRs最小檢測量為0.04-0.2pg。采用該方法對孕穗期和成熟期水稻樣品進行檢測,發現不同生長階段的水稻樣品中BRs含量顯示出明顯的差異。 (4)將MSPD與分散固相萃取(dispersive solid-phase extraction, d-SPE)技術相結合,建立了一種分散基質固相萃取(dispersive matrix solid-phase extraction, DMSPE)新方法。先將樣品與固體分散劑一起研磨,然后放入離心管中,加入萃取溶劑離心。在離心過程中,同時完成目標組分的提取和純化。采用該方法對0.02g植物樣品中的內源和外源細胞分裂素進行快速提取和純化,獲得的上清液使用LC-MS/MS分離檢測。對三種細胞分裂素的檢測靈敏度達到0.01-0.06ng/mL,單次進樣的CKs最小檢測量為0.05-0.30pg。方法簡單可靠,避免對樣品過夜溶劑浸提,將樣品前處理時間由傳統方法的12h以上縮短至約0.5h,適用于亞克級植物樣品中細胞分裂素的高靈敏度、高選擇性檢測。
