摘要 隨著“一小時酵母蛋白質組”的實現, 短梯度下實現蛋白質組深度覆蓋成為可能。本文利用全新Q-OT-qIT三合一質譜系統進行“一小時蛋白質組”分析與優化。50 min有效梯度, 單次實驗分別從1 μg和50 ng HeLa全蛋白中鑒定到20860和14100條肽段, 對應到3865和2877個非冗余蛋白, 而目前的文獻報道至少需要2~3 h。同時, 本文考察了Q-OT-qIT碎裂模式、檢測方法、最大注入時間和自動增益控制等參數對蛋白質組快速分析的影響, 證明了不同采集方法間的互補性, 闡述了不同掃描參數對鑒定結果的影響。此外, 還討論了Q-OT-qIT的并列運行原理和掃描組合模式, 為不同實驗目的和樣本類型的蛋白質組快速分析奠定了基礎。
關鍵詞 蛋白質組學 快速鑒定 深度覆蓋 靜電場軌道阱 Q-OT-qIT質譜
蛋白質組深度覆蓋分析(in-depth proteome)已成為蛋白質組學研究的發展趨勢, 通過大規模鑒定和挖掘極低豐度的蛋白, 為信號通路、分子靶點和生物標志物的研究提供重要信息。然而, 由于全蛋白樣本的復雜性, 蛋白質組深度鑒定對色譜分離要求很高, 通常需要進行二維分離(強陰離子交換、高pH反相等), 或使用一維長梯度分離, 以降低高豐度蛋白的干擾[1,2]。但這樣消耗了大量時間, 重現性也不佳, 成為蛋白質組深度覆蓋研究的瓶頸。
靜電場軌道阱(orbitrap)質量分析器具有超高分辨率、超高靈敏度等特點, 有效推動了蛋白質組學的發展[3,4]。新型Q-OT-qIT(Orbitrap Fusion)質譜系統首 次將四極桿(quadrupole, Q)、靜電場軌道阱(orbitrap, OT)和線性離子阱(linear quadrupole ion trap, qIT)3種質量分析器集為一體, 利用動態掃描管理技術, 實現了3種質量分析器同時工作并相互協作, 一級、二級掃描同時進行, 使分析效率達到最大化[5]。Hebert等人[6]利用Q-OT-qIT質譜, 5次重復實驗, 在70min有效梯度下鑒定到約4000個酵母蛋白, 同樣的結果, 目前的文獻報道至少需要4h, 分析效率(單位時間蛋白鑒定數量)提高了4倍以上[7,8]。基于此,Hebert等人[6]首次提出“一小時酵母蛋白質組”的概念, 即1h左右的短梯度實現酵母蛋白質組深度覆蓋。蛋白質組學已進入新的時代。
本文使用Q-OT-qIT質譜系統對HeLa和酵母細胞全蛋白進行短梯度快速鑒定, 并對基于Q-OT-qIT質譜的“一小時蛋白質組”深入考察與優化。結果顯示, 單次實驗、50min有效梯度, 分別從1 μg和50 ng HeLa中鑒定到20860和14100條肽段, 對應3865和2877個非冗余蛋白, 分析效率相比目前的報道提高了至少2~3倍[9]。本文還對比和優化了多種掃描組合和參數設置, 為各類實驗提供了最合適的采集模式。
1 材料與方法
1.1 樣品前處理
分別取適量HeLa和酵母細胞沉淀, 加入含7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)和50 mmol/L二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol,DTT)的蛋白提取液(使用前加入蛋白酶抑制劑), 在超聲細胞破碎儀中超聲3×5s. 冰上放置20min后, 于4℃離心30min(15000×g)并取上清, Bradford法測定總蛋白濃度.
向蛋白提取液中加入DTT, 使終濃度為10 mmol/L, 于56℃振蕩30min. 再加入碘乙酰胺(iodoacetamide, IAM), 使終濃度為50 mmol/L, 于室溫避光振蕩40min. 反應后, 加入6倍體積的預冷丙酮, ?20℃放置3h, 再于4℃離心30min (15000×g)棄上清. 按10 μg/μL的濃度將沉淀重溶于50 mmol/LNH4HCO3緩沖溶液, 并加入足量胰蛋白酶(trypsin), 37℃酶解過夜. 酶解后, 將全蛋白酶解液稀釋至終濃度為0.5 μg/μL.
1.2 納流液相色譜方法
色譜儀: 納流速超高效液相色譜EASY-nLC 1000(Thermo, 美國); 色譜柱: 納流C18EASY-Spray柱(2 μm, 100 ?, 75 μm×25 cm/50 cm), 流速250nL/min; 自制納流C18柱(3 μm, 100 ?, 75 μm×15 cm), 流速300nL/min; 流動相A: 0.1%甲酸-水溶液;流動相B: 0.1%甲酸-乙腈溶液.
50min有效梯度: 0~2min, 3%~5% B; 2~42min, 5%~22% B; 42~52min, 22%~30% B; 52~55min, 30%~90% B; 55~60min, 90% B. 70min有效梯度: 0~5 min, 3%~8% B; 5~60min, 8%~20% B; 60~75min, 20%~30% B; 75~80min, 30%~90% B; 80~90min, 90% B.
1.3 質譜方法
質譜儀: Orbitrap Fusion(Q-OT-qIT)高分辨質譜儀(ThermoFisher, 美國); 離子源: EASY-Spray或Nanospray Flex納升電噴霧源; 噴霧電壓: 2.2 kV; 離子傳輸管溫度: 275℃; RF-lens: 60%.
掃描模式: Top-speed; 循環時間: 3 s; 動態排除: 60 s.
一級掃描: 質量分析器,軌道阱; 掃描范圍,m/z350~1800; 分辨率,120k; 最大注入時間,50 ms; 自動增益控制(AGC): 2e5.
二級IT掃描: 離子選擇,四級桿; 選擇窗口,2 amu; 質量分析器,離子阱(ion trap, IT); 掃描速度,Rapid; 最大注入時間,35 ms; AGC: 1e4; 碎裂模式,HCD; 碎裂能量, 35%.
二級OT掃描: 離子選擇,四級桿; 選擇窗口,2 amu; 質量分析器,軌道阱; 分辨率,15k; 最大注入時間,35 ms; AGC,1e5; 碎裂模式,HCD; 碎裂能量, 35%.
1.4 數據分析
數據使用Proteome Discoverer 1.4軟件搜庫鑒定. 搜索引擎: SEQUEST HT; 數據庫: Uniprot人和酵母蛋白數據庫; 蛋白酶: 胰蛋白酶(full); 最大漏切位點: 2; 母離子質量精度: 10 ppm; 子離子質量精度: 0.6 Da(qIT)/0.02 Da(OT); 固定修飾: Carbamidomethyl(C+57.021 Da); 可變修飾: acetyl(N-terminus+42.011 Da), deamidated(N, Q+0.984 Da), oxidation(M+15.995 Da). 搜庫結果使用Percolator計算q值進行卡值. 同時, 使用Preview軟件分析數據質量.
2 結果與分析
2.1 Q-OT-qIT短梯度分析HeLa和酵母蛋白質組
實驗對1 μg和50 ng HeLa進行50min有效梯度采集, 對1 μg酵母全蛋白進行70min有效梯度采集, 采用OT-HCD-IT掃描模式, 一級軌道阱、二級離子阱掃描, HCD高能碎裂. 結果顯示, 有效出峰時間蛋白酶解產物得到充分分離, 質譜響應良好(圖1). 即使在50 ng的極低樣本量下, 仍獲得良好的分離效果和質譜響應(圖1B).
1 μg HeLa樣本在50min有效梯度內共獲得53209張譜圖, 平均每秒1.7張一級譜圖、16.1張二級譜圖, 平均每循環9.6張二級譜圖; 酵母樣本在70min有效梯度內共獲得60295張譜圖, 平均每秒1.8張一級譜圖、12.5張二級譜圖, 平均每循環6.9張二級譜圖(表1). HeLa細胞比酵母復雜, 存在更多的蛋白, 因此獲得更多的二級譜圖. 此外, 在50 ng HeLa的極低樣本量下, 總譜圖數也達到41099張.
圖1 HeLa和酵母蛋白酶解產物的LC-MS/MS總離子流圖
A: 1 μg HeLa; B: 50 ng HeLa; C: 1 μg酵母
