基因工程操作技術及原理之基因克隆

1．克隆已知序列的基因

根據已知基因的序列設計引物(primer)，利用PCR方法克隆基因。即使不同種屬之間，基因編碼區序列的同源性高于非編碼區的序列。在某種植物的同源基因被克隆的條件下，可先構建eDNA文庫或基因組文庫，然后以該基因(或部分序列)為探針來篩選目的基因的克隆。

2．功能克隆

根據基因的產物蛋白質克隆基因，利用這種方法分離基因，首先應根據已知的生化缺陷或特征確認與該功能有關的蛋白質，再分離純化這一蛋白并制備相應抗體；或測定其氨基酸序列，推測可能的mRNA序列，根據mRNA序列設計相應的核苷酸探針或寡核苷酸引物。利用抗體或核苷酸探針篩選基因組DNA文庫或cDNA文庫，也可利用寡核苷酸引物對核DNA或cDNA進行PCR擴增。通過對陽性克隆或PCR擴增產物的序列分析鑒定分離基因。

3．作圖克隆

作圖克隆又稱圖位克隆，是隨著分子標記圖譜的建立而發展起來的基因克隆技術。根據連鎖圖譜定位的基因來克隆目的基因。作圖克隆是從連鎖標記出發，通過大片段克隆(BAC庫或YAC庫)的染色體步移(chromommewalking)到達靶基因。

4．表型差異克隆

利用表型差異或組織器官特異表達產生的差異來克隆基因，對于有些植物的性狀，既不了解它們的基因產物也沒有對它們進行基因定位，但已知它們的表型存在差異，利用這些差異，用下述方法也可克隆植物基因。

(1)消減雜交法    即消減雜交法(subtractive hybridization)是通過鑒定兩個mRNA間差異而分離基因的方法。其基本方法是：提取兩種差異細胞或組織的DNA后，反轉錄合成cDNA，并用限制性內切核酸酶切割成小片段。

將其中一個樣品的酶切產物分成兩份，分別連接不同的含有特定酶切位點的40bp左右的寡核苷酸接頭，作為檢測者(tester)。用另外一個樣品過量的酶切產物作為驅動者(driver)與帶有不同接頭的tester進行第一次雜交。將獲得的第一次雜交產物混合，同時加入新的變性driver進行第二次雜交，雜交完全后補平接頭。加入以兩種接頭序列設計的單鏈寡核苷酸引物，對雜交補平后的產物進行PCR擴增，獲得目的基因。

(2)DNA標簽法(DNAtagging)    又稱轉座子標簽(transposontagging)、T―DNA標簽(T―DNAtagging)和反轉錄轉座子標簽(retrotransposontagging)。所有的標簽技術都基于標簽序列的已知性。

該法是利用轉座子或T―DNA插入生物的基因組中引起某一基因失活產生一些突變體，然后用相應轉座子或T―DNA對突變體文庫進行篩選，以篩選到的陽性克隆片段為探針，再篩選野生型生物基因文庫分離目的基因。

(3)差別顯示技術(differentialdisplay)    包括mRNA差別顯示法、基因表達連續分析法、代表性差式分析法、抑制消減雜交法、有序差異顯示、基因表達指紋、標簽接頭競爭PCR、基因組差異顯示、cDNA3，端限制性酶切片段顯示等。

(4)缺陷互補和反義mRNA技術    缺陷互補就是利用某一給定的cDNA文庫，通過遺傳轉化來補充宿主特定的代謝基因缺陷，獲得目的基因的方法。

反義mRNA技術是依據所要抑制表達的基因，人工設計合成的反義基因轉化宿主后，在宿主中轉錄成mRNA，即反義mRNA。這種反義mRNA能與原基因所轉錄出來的mRNA互補，當其劑量遠大于原基因所轉錄出來的mRNA時，就形成復合體。這種復合體不能進行跨核孔運輸，也就抑制了宿主基因的表達。這樣，通過表型的變化就可以判斷基因的功能，從而克隆到此基因。

(5)cDNA微陣歹，J和基因芯片技術     是利用原位合成法或將已合成好的一系列寡核苷酸或cDNA固定在介質上，制備成低密度或高密度的寡核苷酸陣列。利用這樣的芯片，與不同條件下從某種生物體中轉錄出來的并被標記的所有mRNA雜交，通過分析雜交位點信號的強弱進而找出目的基因。常用于基因的表達分析及基因分離。

5．染色體大片段基因克隆

利用酵母或細菌制備人工染色體基因組文庫，從中克隆基因，如酵母雙雜交體系可以分離能與已知的靶蛋白質相互作用的蛋白質的編碼基因