①引物的序列應位于基因組DNA的高度保守區,且與非擴增區無同源序列。這樣可以減少引物與基因組的非特異性結合,提高反應的特異性
②引物長度:15-40bp為宜。引物過短或過長均可使反應的特異性下降。
③引物的堿基盡可能隨機發布,避免出現數個嘌呤或嘧啶的連續排列,G+C堿基的含量在40%-75%之間。
④引物內部應避免形成二級結構,特別是引物的末端應避免有回文結構。
⑤二個引物不應有互補序列,特別是3’端應避免互補,以免形成“引物二聚體”,浪費引物。
⑥引物5’末端堿基無嚴格限制,在與模板DNA結合的引物長度足夠的條件下,其5’端堿基可不與模板DNA互補而呈游離狀態,因此可在引物5’端加上限制性內切酶位點、啟動子序列或其它序列等以便于PCR產物的分析克隆等,引物的5’端至多可加10個堿基而對PCR反應無影響。