為了確定探針是否與相應的基因組DNA雜交，有必要對探針加以標記，以便在結合部位獲得可識別的信號,通常采用放射性同位素32P標記探針的某種核苷酸α磷酸基。但近年來已發展了一些用非同位素如生物素、地高辛配體等作為標記物的方法。但都不及同位素敏感。非同位素標記的優點是保存時間較長,而且避免了同位素的污染。最常用的探針標記法是缺口平移法(nicktranslation)。
探針的標記也可以采用隨機引物法，即向變性的探針溶液加入6個核苷酸的隨機DNA小片段，作為引物，當后者與單鏈DNA互補結合后，按堿基互補原則不斷在其3’OH端添加同位素標記的單核苷酸，這樣也可以獲得比放射性很高的DNA探針。