基因敲除技術概述（三）

2.1.2.2 誘導性基因敲除法

誘導性基因敲除也是以Cre/loxp 系統為基礎，但卻是利用控制Cre 表達的啟動子的活性或所表達的Cre 酶活性具有可誘導的特點，通過對誘導劑給予時間的控制或利用Cre 基因定位表達系統中載體的宿主細胞特異性和將該表達系統轉移到動物體內的過程在時間上的可控性，從而在1oxP 動物的一定發育階段和一定組織細胞中實現對特定基因進行遺傳修飾之目的的基因敲除技術。人們可以通過對誘導劑給予時間的預先設計的方式來對動物基因突變的時空特異性進行人為控制、以避免出現死胎或動物出生后不久即死亡的現象。常見的幾種誘導性類型如下：四環素誘導型(圖4)；干擾素誘導型；激素誘導型；腺病毒介導型。

圖5.四環素誘導的基因敲除過程示例圖

誘導性基因敲除優點：

① 誘導基因突變的時間可人為控制；

② 可避免因基因突變而致死胎的問題

③ 在2 個loxP 位點之間的重組率較高；

④如用病毒或配體／DNA 復合物等基因轉移系統來介導Cre 的表達，則可省去建立攜帶Cre 的轉基因動物的過程。[10]

2.2利用隨機插入突變進行基因敲除。

2.2.1 原理：

此法利用某些能隨機插入基因序列的病毒，細菌或其他基因載體，在目標細胞基因組中進行隨機插入突變，建立一個攜帶隨機插入突變的細胞庫，然后通過相應的標記進行篩選獲得相應的基因敲除細胞（原理見圖5）[11,12] 。根據細胞的不同，插入載體的選擇也有所不同。逆轉率病毒可用于動植物細胞的插入；對于植物細胞而言農桿菌介導的T-DNA轉化和轉座子比較常用；噬菌體可用于細菌基因敲除。

插入了靶目標的基因轉錄翻譯出無活性的目標蛋白隨機插入內含子中．需要敲除的靶基因轉錄翻譯出活性蛋白

圖6：基因捕獲法的基本原理圖

2.2.2基因捕獲法

基因捕獲法是最近發展起來的利用隨機插入突變進行基因敲除的新型方法，其原理可見圖6。通常基因捕獲載體還包括一個無啟動子的報道基因，通常是neo 基因，neo 基因插入到ES 細胞染色體組中，并利用捕獲基因的轉錄調控元件實現表達的ES 克隆可以很容易地在含G418 的選擇培養基中篩選出來，從理論上講，在選擇培養基中存活的克隆應該100％地含有中靶基因。中靶基因的信息可以通過篩選標記基因側翼cDNA或染色體組序列分析來獲得[13]

2.2.3基因捕獲法的優缺點

用常規方法進行基因敲除研究需耗費大量的時間和人力，研究者必須針對靶位點在染色體組文庫中篩選相關的染色體組克隆，繪制相應的物理圖譜，構建特異性的基因敲除載體以及篩選中靶ES 細胞等，通常一個基因剔除純合子小鼠的獲得需要一年或更長的時間。面對人類基因組計劃產生出來的巨大的功能未知的遺傳信息，傳統的基因敲除方法顯得有些力不從心。因此，基因捕獲法應運而生，利用基因捕獲可以建立一個攜帶隨機插入突變的ES 細胞庫，節省大量篩選染色體組文庫以及構建特異打靶載體的工作及費用，更有效和更迅速地進行小鼠染色體組的功能分析。

此方法的缺點是只能剔除在Es 細胞中表達的基因．單種的細胞類型中表達的基因數目約為I04，現在的基因捕獲載體從理論上來講應能剔除所有在ES細胞表達的基因，因此，在ES 細胞中進行基因捕獲還是大有可為的。用基因捕獲法進行基因剔除的另一個缺點是無法對基因進行精細的遺傳修飾。

2.3.RNAi引起的基因敲除。

由于少量的雙鏈RNA就能阻斷基因的表達，并且這種效應可以傳遞到子代細胞中,所以RNAi的反應過程也可以用于基因敲除。近年來，越來越多的基因敲除采用了RNAi這種更為簡單方便的方法。[13-15]

2.3.1 RNAi阻斷基因表達的機理

雙鏈RNA進入細胞后，能夠在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，而另一方面雙鏈RNA還能在RdRP （以RNA為模板指導RNA合成的聚合酶RNA-directed RNApolymerase，RdRP）的作用下自身擴增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA的雙鏈解開變成單鏈，并和某些蛋白形成復合物，Argonaute2是目前唯一已知的參與復合物形成的蛋白。此復合物同與siRNA互補的mRNA結合，一方面使mRNA被RNA酶裂解，另一方面以SiRNA作為引物，以mRNA為模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互補鏈。結果mRNA也變成了雙鏈RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。這些新生成的siRNA也具有誘發RNAi的作用，通過這個聚合酶鏈式反應，細胞內的siRNA大大增加，顯著增加了對基因表達的抑制。從21到23個核苷酸的siRNA到幾百個核苷酸的雙鏈RNA都能誘發RNAi，但長的雙鏈RNA阻斷基因表達的效果明顯強于短的雙鏈RNA