普通的PCR反應體系中，加入的核苷酸單體為4種2′-脫氧核苷三磷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)。測序反應體系中，加入的核苷酸單體為2',3雙脫氧核苷三磷酸( ddNTP)。與dNTP相比，ddNTP在脫氧核糖的位置上缺少個羥基，反應過程中雖然可以在DNA聚合酶作用下，通過其磷酸基團與正在延伸的DNA鏈的末端脫氧核糖-OH發生反應，形成磷酸二酯鍵而摻入到DNA鏈中，但它們本身沒有-OH，不能同后續的dNTP形成磷酸二酯鍵，從而使正在延伸的DNA鏈在此終止。
根據這一原理分別設計四個反應體系，每一反應體系中存在相同的DNA模板、引物、四種dNTP和一種ddNTP(如ddATP)，則新合成的DNA鏈在可能摻入正常dNTP的位置都有可能摻入ddNTP，導致新合成鏈在不同的位置終止。由于存在ddNTP與dNTP的競爭，生成的反應產物是一系列長度不同的多核苷酸片段。
將制得的四組混合物全部平行地點加在電泳板上進行電泳，每組制品中的各個組分將按其鏈長的不同得到分離，從而制得相應的放射性自顯影圖譜。從所得圖譜即可直接讀得DNA的堿基序列
