基因測序

第1代測序技術——熒光標記的Sanger法

在第一臺全自動測序儀出現之前，使用最為廣泛的測序方法就是 Sanger 在 20 世紀 70 年代中期發明的末端終止法測序技術。 Sanger 也因此獲得 1980年的諾貝爾化學獎。 他的發明第一次為科研人員開啟了深入研究生命遺傳密碼的大門。

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            最早版本的第1代測序儀是20世紀80年代中期在CalTech的LeroyHood實驗室發明的。這一測序儀通過修改Sanger法得以實現。最關鍵的改變是采用具有顏色的熒光染料代替同位素標記。4種雙脫氧核苷酸終止子被標記上不同顏色的熒光基團。另外，與最初的Sanger法不同，熒光基是標記在終止子上，而不是在引物上。這種不同顏色標記的方案可以實現一個反應管中同時進行4個末端終止反應。采用聚丙烯酰胺凝膠分離，并通過計算機熒光檢測系統分析梯狀反應產物。這些改進極大地提高了測序速度，減少了測序過程中的人為干擾。次年，利用LeroyHood實驗室的技術，ABI推出了第一款半自動DNA測序儀ABI370。在隨后的20年中，測序儀的性能得到了極大的提升。但基本工作原理直到最近才有所改變。

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            第1代測序儀的第2個版本出現在20世紀末。這一版本的測序儀，其測序速度與質量得到了進一步的提高。這主要歸功于兩方面的工作:第一，平板電泳分離技術被毛細管電泳所取代;第二，通過更高程度的并行化使得同時進行測序的樣本數量增加。使用毛細管替代平板凝膠取消了手工上樣，降低了試劑的消耗，提升了分析的速度。另外，緊湊的毛細管電泳設備的形式更易于實現并行化，可以獲得更高的通量ABI3730測序儀和AmershamMega-BACE分別可以在一次運行中分析96個或384個樣本。這一代測序儀在人類基因組計劃DNA測序的后期階段起到了關鍵的作用，加速了人類基因組計劃的完成。而且由于其在原始數據質量以及序列讀長方面具有的優勢，這些測序儀今天還在使用之中。

第2代測序技術——循環陣列合成測序法

所謂二代測序方法，包括大量基于不同技術的方法. 盡管從模板文庫制備、片段擴增到測序， 這些方法所采用的技術與生物化學相當多樣，但是都采用了大規模矩陣結構的微陣列分析技術——陣列上的DNA樣本可以被同時并行分析.此外，測序是利用DNA聚合酶或連接酶以及引物對模板進行一系列的延伸，通過顯微設備觀察并記錄連續測序循環中的光學信號實現的。

第3代測序技術——直接測序

在所有上述第2代測序技術中，序列都是在熒光或者化學發光物質的協助下，通過讀取DNA聚合酶或DNA連接酶將堿基連接到DNA鏈上過程中釋放出的光學信號而間接確定的，除了需要昂貴的光學監測系統，還要記錄、存儲并分析大量的光學圖像，這都使儀器的復雜性和成本增加，依賴生物化學反應讀取堿基序列更增加了試劑、耗材的使用，在目前測序成本中比例相當大，直接讀取序列信息，不使用化學試劑，對于進一步降低測序成本是非常可取的，在一個正在發生突破瓶頸巨變的領域內，很難準確預測未來將發生什么，但是，最近幾個領域大量的研究工作表明未來新一代的測序平臺將在其中產生。

非光學顯微鏡成像

最近，日本大阪大學的研究小組發現，在一條拉長的DNA鏈上，利用掃描隧道顯微鏡的圖像，根據獨特的電子指紋，可以將鳥嘌呤與其他3種堿基區分開來。另外一些團隊一直積極地致力于使用原子力顯微鏡來記錄將每個堿基緊密連接的環拉開所需力的大小，以區分不同的堿基。而ZSGenetics公司致力于使用電子顯微鏡直接測序。為了解決天然DNA分子在電子顯微鏡下對比度不足的問題，他們在聚合酶合成新DNA鏈時加入更重的元素。在電子顯微鏡下觀察就可以獲得的更重的DNA并確定其序列。

納米孔

    顧名思義，納米孔就是直徑在納米尺度的小孔(1~2nm)。通常是利用固態物質或者生物分子制成的小孔。這種想法是在電場驅動下，當線狀DNA分子通過小孔時，通過一些物理手段來確定堿基的序列。在全球，許多公司和組織，如Agilent，DNAElectronics，IBM，NabSys，OxfordNanoporeTechnologies，Sequenom等都在進行納米孔測序的開發，但采用的方法不同。

石墨烯和碳納米管

    石墨烯是由碳原子構成的二維晶體，碳原子排列與石墨的單原子層一樣。非常穩定并具有非常良好的導電性，非常適合制作核酸測序用電極的材料。有種設想是在石墨烯上打出一個大約1nm寬的縫隙。引導DNA分子垂直通過縫隙。當DNA通過時，縫隙兩邊的石墨烯邊緣可以作為電極來確定核酸的序列。除了在石墨烯上打出這樣一個縫隙是一種挑戰之外，控制DNA的運動、移動的方向以及通過縫隙的速度同樣是不小的障礙。

        所有的下一代測序平臺遵循了類似的工作流程，都要經過克隆擴增以加強測序過程中的光學檢測靈敏度。目前已經有3種廣泛使用的商業化測序平臺平臺，它們分別是Illumina的GenomeAnalyzer，羅氏454基因組測序儀以及ABLifeTechnologies的SOLiD系統。它們基本都是在20世紀90年代末被發明和開發出來，在2005年前后商業化。Polonator.G.007是最近剛剛實現商業化的新設備，該儀器最初由哈佛大學GeorgeChurch實驗室開發，現在由DoverSystems公司制造。CompleteGenomics公司最近推出了基于其ZL技術的測序服務平臺，但該公司并沒有表示要在市場銷售這一設備。這些儀器都采用了合成測序法，只是在DNA陣列的排布、DNA簇擴增，以及基于酶的測序生化反應方面存在差異。

Illumina Genome Analyzer

Illumina公司的測序儀采用合成測序法，使用熒光標記的核苷酸以及可逆的終止子。在每一輪測序循環中，標記不同熒光基團的4種核苷酸以及DNA聚合酶同時加入流通池通道中，按照堿基互補配對的原則進行DNA鏈的延伸。每個核苷酸的3′羥基是被封閉起來，以防止額外的延伸。采集熒光圖像，堿基特異的熒光標記揭示了這一輪中新加入核苷酸是什么，也就獲得模板中這一位置的DNA序列。然后，打開3′端，繼續進行下一輪反應。這一過程重復多次，到50個循環，產生50個堿基的DNA序列。

Roche 454 Genome Sequencer

454測序儀利用微乳滴PCR(emulsionPCR，emPCR)來生成擴增產物。將固化引物的微球與單鏈DNA文庫模板以及必要的PCR反應化合物一起混合，微球與文庫片段的比例適當，以確保大多數微球結合的單鏈DNA分子不超過一個。水溶液與油混合形成油包水結構乳滴。每個乳滴都是一個進行后續PCR反應的微型化學反應器。經過多輪熱循環，每個微球表面都結合了數千個相同的DNA拷貝。然后富集微球，轉移并放置到刻有規則微孔陣列的微孔板上。每個微孔只能容納一個微球。微孔板被安裝成為流通池的一部分。其中一面可以通過測序反應的化合物，另一面則與CCD光學檢測系統的光纖部件相接觸。

Life Technologies SOLiD System

與454的情況相同，SOLiD系統也采用了微乳滴PCR與微球相結合的策略來擴增DNA模板.打破微乳滴后，擴增微球被收集、富集并固定在一個平的玻璃基板上形成一個無規則的陣列。

Polonator G.007. Polonator

Polonator.G.007， Polonator 是另外一款使用連接測序技術的下一代測序儀，它采用的是單堿基探針,而不是上述雙堿基編碼的策略，測序是通過在結合到經微乳滴PCR擴增的DNA簇上的通用引物與九堿基探針之間的一系列連接反應進行的，每次連接反應,將一個九堿基探針池與DNA連接酶一起加入,以進行引物-探針連接。九堿基探針池中包括很多熒光標記的變性寡核苷酸探針。熒光標記與每個讀取位置對應(即熒光顏色與讀取位置的堿基相對應)，每次連接之后獲取熒光圖像，然后,延伸的引物——探針鏈經變性進行系統重置，接下來,對下一個讀取位置進行引物與第2個九堿基探針池之間的連接，這一重置-連接-獲取圖像的過程重復進行,直到所有位置的信息被讀取。

30年的創新和發展開創了基因組測序的新時代.測序技術從手工的一次一個樣品發展成為基于大規模陣列的高度自動化技術.測序通量呈指數提高,而成本急劇降低.由于當前的以及即將出現的更新一代測序技術,1000美元基因組的目標將變得更加現實.快速、廉價的測序能力將引領我們開辟比較基因組學分析、疾病診斷以及個性化(個體化)醫療等新領.由于其在科研以及經濟方面的巨大利益,中國應該在21世紀這一關鍵技術的研究開發方面發揮更大的作用,并積極促進其在生命科學研究以及醫藥領域的廣泛應用.當全部現存生物的基因組及其有意義的變異都被發現并掌握時,做出這些貢獻的人應該感到無比的自豪！