基因組物理圖譜的構建不需要經過減數分裂的世代群體，可直接利用DNA分子分析，主要有以下三種構建途徑：
限制性酶圖譜。利用限制性內切酶構建圖譜，對于DNA分子長度在50kb以下的片段，一般沒有什么困難。而對于大于50kb的DNA分子，可選用稀有切點的內切酶酶切DNA。
（1）用識別較多核苷酸的內切酶，如NotI。
（2）選用其酶切位點在基因組中出現頻率低的內切酶。
熒光原位雜交。熒光原位雜交技術（fluorescent in situ hybridization, FISH）是另一種物理圖譜的構建方法。它通過熒光標記的探針與DNA分子雜交，使染色體上的雜交信號在顯微鏡下可直接觀察。原位雜交中的探針可用熒光或同位素標記。染色體上出現雜交信號的位置，就是探針DNA在染色體上的圖譜位點。方法是取有絲分裂中期的細胞制片，將染色體變性成單鏈，再講變性的DNA探針變性后加到染色體上，保溫及處理后記錄結果。在FISH中，一個克隆的DNA片段就可作為雜交的探針。
序列標簽位點。利用某一已知序列為標簽的位點（sequence tagged site, STS）作探針，與基因組DNA雜交，繪制物理圖譜。作為STS，需要具備兩個條件：一是其序列是已知的，以便用PCR檢測；二是在基因組中僅一個位點，沒有重復。