基因組DNA文庫構建的基本流程

基因組  DNA文庫有十分廣泛的用途，如用于分析、分離特定的基因片段，用以基因表達調控、人類及動植物基因組工程的研究。通常情況下，基因組文庫構建的基本流程可以歸為4大步驟：分離基因組DNA、對基因組DNA作相關的處理、將基因組DNA片段連接入載體、將重組載體轉入宿主細胞。

一、分離基因組DNA(gDNA)

毫無疑問，優質的基因組DNA對于基因組文庫構建是至關重要的。研究者需要查閱文獻，通過經驗來選擇合適的基因組DNA分離方法，在分離過程中保證DNA不被過度剪切或降解，同時也要盡量保證DNA的純度。

二、處理基因組DNA

根據研究目的，研究者需要選擇合適的載體。不同的載體對基因組DNA的長度有不同的要求，研究者必須選擇合適長度的基因組DNA來構建基因組文庫。

比如，對于黏粒載體(比如Epicntre的pCC1FOSTM、pEpiFOSTM-5、pWEB-TNCTM、pWEBTM)，合適的片段長度大約為40kb;對于BAC載體(比如Epicentre的pIndigoBAC-5、pCC1BACTM)，平均來說，合適的片段長度為120kb-300kb。

構建黏粒基因組DNA文庫，研究者需要將基因組DNA用注射器抽打來隨機剪切DNA;接著用末端修復酶修復DNA，可以提高DNA連接   入載體的效率;然后通過脈沖場電泳或者普通電泳來找到40kb左右的DNA片段，隨后使用Epicentre GELase 膠回收試劑盒回收DNA。

構建BAC基因組DNA文庫，研究者需要將基因組DNA用限制性內切酶  (常用EcoR I、BamH I或者Hind III)來消化基因組DNA，然后通過脈沖場電泳找到合適長度的DNA片段(比如100kb-150kb)，隨后透析回收DNA。

需要注意：

(1)電泳時，要選用合適的DNA Ladder，以保證電泳后可以準確定位所需分子量的DNA。用Epicentre試劑盒構建黏粒文庫時，就可以直接采用文庫試劑盒內的Control Insert DNA來做marker，既方便又準確。

(2)電泳以后，應該避免用紫外光照射目標DNA，紫外光照射DNA會顯著降低克隆效率。解決方法：把marker所在的部分凝膠切下，在紫外燈下做好記號，然后以此為參考定位所需的片段。

(3)回收DNA的時候，應該要避免過度離心，以防止DNA被剪切，降低文庫質量。

三、載體的選擇

目前，常用的基因組文庫載體有黏粒載體、P1噬菌體載體、PAC載體(P1人工染色體)、BAC載體(細菌人工染色體)和YAC載體(酵母人工染色體)。選用何種載體可以參考如下幾個因素：

1.目標區域的大小

如果基因組的目標區域很小(小于50kb)，那么可以選擇黏粒載體甚至是λ噬菌體載體。利用現有的商品化的黏粒載體、高效率的包裝混合物和合適的大腸桿菌菌株，研究者可以方便的構建黏粒載體文庫。

如果基因組的目標區域比較大，那么P1、PAC或者BAC就比較合適了。P1操作比較困難，PAC相對簡便。BAC載體也是很好的選擇，研究者可以利用現有的成熟產品來構建BAC文庫，比如EPICENTRE公司的一系列BAC載體及配套試劑盒。

如果目標區域非常大(大于250kb)，那么YAC載體就是首選了。不過，應用YAC載體來構建基因組文庫，操作非常繁瑣困難，一般由專門的公司來完成。

表1 各種載體的比較

2.篩選文庫的難易程度

黏粒載體一般使用傳統的濾膜影印雜交來篩選，但是這種方法對于構建區域圖譜及疊連群來說既費力又浪費。大容量載體文庫，如P1、PAC、BAC、YAC，以二維陣列保存，既可以用傳統的單拷貝的探針雜交法篩選，又可以用PCR進行多克隆的群體篩選。而且，使用高容量載體構建文庫，可以減少染色體步查的步驟。

3.載體拷貝數的考慮

當把大片段DNA片段克隆到高拷貝的載體時，克隆DNA會發生重組，從而影響克隆序列的保真性和穩定性;而單拷貝載體的低產量DNA是高通量分析的瓶頸。這個矛盾常常困擾著研究者。

而EPICENTRE’s CopyControlTM 克隆系統是對這些困難的最好的解決方案。CopyControlTM技術整合了單拷貝載體與多拷貝載體的優點。單拷貝載體能提高插入片段的穩定性，而且拷貝載體能在誘導劑的作用下，即時擴增出高拷貝數的克隆而獲得高產量的DNA。

四、將基因組DNA片段連接入載體

使用連接酶把上述大小合適的DNA片段連接入載體。Epicentre的商業化載體已經經過預處理，可以直接使用，無需內切酶消化及脫磷酸化處理。連接酶可以選用Epicentre Fast-Link DNA Ligase，連接快、效率高。連接反應體系以100ul為宜。

注意：BAC載體連接完以后，需要將連接產物做脫鹽處理，除去連接反應緩沖液里的鹽分。脫鹽可以用Epicentre推薦的Agarose Cone方法，省時省力，防止DNA被剪切。

五、將重組載體轉入宿主細胞

如果使用Epicentre試劑盒構建黏粒文庫，需要用Epicentre MaxPlax Lambda Packaging Extracts 來包裝上述的連接反應產物，測定包裝好的黏粒克隆的滴度，然后轉染Epicentre EPI300-T1?Plating Strain。挑出重組子，鑒定插入片段的大小。如果文庫的大小和質量都令人滿意的話,

就可以鋪板進行文庫篩選，或者擴增、保存文庫。

如果使用Epicentre試劑盒構建BAC文庫，應選擇電轉法，可以選擇Epicentre TansforMaxTM EPI300TM Electrocompetent E.coli 作為宿主，將上述連接產物轉入細菌，涂板長出克隆后。

獲得克隆，研究者需要對BAC克隆的大小進行評估，確定文庫大小是否能夠滿足要求。Epicentre 文庫構建試劑盒中的EPILyse和EPIBlue，快速裂解克隆并電泳，可以方便的鑒定出BAC克隆的大小，從而估計出BAC文庫的大小。如果文庫大小合適，那么這個文庫就可以進行后續的操作了。

六、文庫克隆數的確定

基因組DNA文庫需要包含足夠多的克隆，來保證文庫的代表性。一般使用如下的經驗公式來確定：

N = ln (1-P ) / ln (1-f ) P是希望得到的覆蓋率，f是插入片段大小與基因組DNA大小的比值，N是所需的克隆數。

舉例來說，用BAC載體構建人類基因組文庫，人類基因組大小為3 x 109 bp, 插入片段大小為100kb，希望覆蓋率99%，那么所需要的BAC克隆數為

N = ln (1 - 0.99) / ln (1 - [106bp / 3 x 109 bp]) = -4.61 / -3.33 x 10-6 = 138,298