基因芯片檢測原理（二）

發布時間：2020-07-27 17:46 原文鏈接：基因芯片檢測原理（二）

1．熒光標記雜交信號的檢測方法

使用熒光標記物的研究者最多，因而相應的探測方法也就最多、最成熟。由于熒光顯微鏡可以選擇性地激發和探測樣品中的混合熒光標記物，并具有很好的空間分辨率和熱分辨率，特別是當熒光顯微鏡中使用了共焦激光掃描時，分辨能力在實際應用中可接近由數值孔徑和光波長決定的空間分辨率，而在傳統的顯微鏡是很難做到的，這便為DNA芯片進一步微型化提供了重要的檢測方法的基礎。大多數方法都是在人射照明式熒光顯微鏡（epifluoescence microscope）基礎上發展起來的，包括激光掃描熒光顯微鏡、激光共焦掃描顯微鏡、使用了CCD相機的改進的熒光顯微鏡以及將DNA芯片直接制作在光纖維束切面上并結合熒光顯微鏡的光纖傳感器微陣列。這些方法基本上都是將待雜交對象以熒光物質標記，如熒光素或麗絲膠（lissamine）等，雜交后經過SSC和SDS的混合溶液或SSPE等緩沖液清洗。

（1）激光掃描熒光顯微鏡

探測裝置比較典型。方法是將雜交后的芯片經處理后固定在計算機控制的二維傳動平臺上，并將一物鏡置于其上方，由氬離子激光器產生激發光經濾波后通過物鏡聚焦到芯片表面，激發熒光標記物產生熒光，光斑半徑約為5－10μm。同時通過同一物鏡收集熒光信號經另一濾波片濾波后，由冷卻的光電倍增管探測，經模數轉換板轉換為數字信號。通過計算機控制傳動平臺X－Y方向上步進平移，DNA芯片被逐點照射，所采集熒光信號構成雜交信號譜型，送計算機分析處理，最后形成20μm象素的圖像。這種方法分辨率高、圖像質量較好，適用于各種主要類型的DNA芯片及大規模DNA芯片雜交信號檢測，廣泛應用于基因表達、基因診斷等方面研究。

(2)激光掃描共焦顯微鏡

激光掃描共焦顯微鏡與激光掃描熒光顯微鏡結構非常相似，但是由于采用了共焦技術因而更具優越性。這種方法可以在熒光標記分子與DNA芯片雜交的同時進行雜交信號的探測，而無須清洗掉未雜交分子，從而簡化了操作步驟大大提高了工作效率。Affymetrix公司的S．P．A．Forder等人設計的DNA芯片即利用此方法。其方法是將靶 DNA分子溶液放在樣品地中，芯片上合成寡核苷酸陣列的一面向下，與樣品池溶液直接接觸，并與DNA樣品雜交。當用激發光照射使熒光標記物產生熒光時，既有芯片上雜交的DNA樣品所發出的熒光，也有樣品地中DNA所發出的熒光，如何將兩者分離開來是一個非常重要的問題。而共焦顯微鏡具有非常好的縱向分辨率，可以在接受芯片表面熒光信號的同時，避開樣品池中熒光信號的影響。一般采用氬離子激光器（488nm）作為激發光源，經物鏡聚焦，從芯片背面入射，聚集于芯片與靶分子溶液接觸面。雜交分子所發的熒光再經同一物鏡收集，并經濾波片濾波，被冷卻的光電倍增管在光子計數的模式下接收。經模數轉換反轉換為數字信號送微機處理，成像分析。在光電信增管前放置一共焦小孔，用于阻擋大部分激發光焦平面以外的來自樣品池的未雜交分子熒光信號，避免其對探測結果的影響。激光器前也放置一個小孔光闌以盡量縮小聚焦點處光斑半徑，使之能夠只照射在單個探針上。通過計算機控制激光束或樣品池的移動，便可實現對芯片的二維掃描，移動步長與芯片上寡核苷酸的間距匹配，在幾分鐘至幾十分鐘內即可獲得熒光標記雜交信號圖譜。其特點是靈敏度和分辨率較高，掃描時間長，比較適合研究用。現在 Affymetrix公司已推出商業化樣機，整套系統約 12萬美元。

（3）采用了CCD相機的熒光顯微鏡

這種探測裝置與以上的掃描方法都是基于熒光顯微鏡，但是以CCD相機作為信號接收器而不是光電倍增管，因而無須掃描傳動平臺。由于不是逐點激發探測，因而激發光照射光場為整個芯片區域，由CCD相機獲得整個DNA芯片的雜交譜型。這種方法一般不采用激光器作為激發光源，由于激光束光強的高斯分布，會使得光場光強度分布不均，而熒光信號的強度與激發光的強度密切相關，因而不利于信號采集的線性響應。為保證激發光勻場照射，有的學者使用高壓汞燈經濾波片濾波，通過傳統的光學物鏡將激發光投射到芯片上，照明面積可通過更換物鏡來調整；也有的研究者使用大功率弧形探照燈作為光源，使用光纖維束與透鏡結合傳輸激發光，并與芯片表面呈50o角入射。由于采用了CCD相機，因而大大提高了獲取熒光圖像的速度，曝光時間可縮短至零點幾秒至十幾秒。其特點是掃描時間短，靈敏度和分辨率較低，比較適合臨床診斷用[14].

（4）光纖傳感器

有的研究者將 DNA芯片直接做在光纖維束的切面上（遠端），光纖維束的另一端（近端）經特制的耦合裝置耦合到熒光顯微鏡中。光纖維束由7根單模光纖組成。每根光纖的直徑為200μm，兩端均經化學方法拋光清潔。化學方法合成的寡核苷酸探針共價結合于每根光纖的遠端組成寡核苷酸陣列。將光纖遠端浸入到熒光標記的靶分子溶液中與靶分子雜交，通過光纖維束傳導來自熒光顯微鏡的激光（490urn），激發熒光標記物產生熒光，仍用光纖維束傳導熒光信號返回到熒光顯微鏡，由CCD相機接收。每根光纖單獨作用互不干擾，而溶液中的熒光信號基本不會傳播到光纖中，雜交到光纖遠端的靶分子可在90％的甲酸胺（ formamide）和TE緩沖液中浸泡10秒鐘去除，進而反復使用。這種方法快速、便捷，可實時檢測DNA微陣列雜交情況而且具有較高的靈敏度，但由于光纖維束所含光纖數目有限，因而不便于制備大規模DNA芯片，有一定的應用局限性。

2.．生物素標記方法中的雜交信號探測

以生物素（biotin）標記樣品的方法由來已久，通常都要聯合使用其它大分子與抗生物素的結合物（如結合化學發光底物酶、熒光素等），再利用所結合大分子的特殊性質得到最初的雜交信號，由于所選用的與抗生物素結合的分子種類繁多，因而檢測方法也更趨多樣化。特別是如果采用尼龍膜作為固相支持物，直接以熒光標記的探針用于DNA芯片雜交將受到很大的限制，因為在尼龍膜上熒光標記信號信噪比較低。因而使用尼龍膜作為固相支持物的這些研究者大多是采用生物素標記的。

目前應用較多的是美國General Scanning公司開發的基因芯片專用檢測系統(ScanArray 3000)，采用激光共聚焦掃描原理進行熒光信號采集，由計算機處理熒光信號，并對每個點的熒光強度數字化后進行分析。近期又開發出了ScanArray 5000，其掃描精度和功能有較大的提高。