基因表達系列分析實驗（SAGE）

感興趣的細胞或組織

糖原EDTA緩沖液SDSBSATween 20連接子T4 DNA 連接酶BsmFIPC8SeeDNA乙酸鈉乙醇DMSOPCR引物乙酸銨DNA ladder聚丙烯酰胺 TBE凝膠DNA參照pZErO-1 質粒TE緩沖SOC培養液Tris · Cl

微量離心管水浴鍋帶冷凍的熱控制 循環儀96 孔 PCR 板干冰 甲醇浴臺式離心機平臺型搖床UV 盒濾鏡Spin-X 離心過濾管微電擊杯Bio-Rad 基因脈沖電轉裝置培養管

實驗所需「材料」、「試劑」、「耗材」具體見「其他」

1. 刮取細胞時準備 Dynabeads ，洗滌緩沖液和 5×第一鏈緩沖液混合液（置于冰上）。

2. 充分懸起 Dynabeads oligo （dT）₂₅，轉移 100 ul 到一個無 RNase 的硅烷化微量離心管里，置于磁座上。30 s 后去除上清，不要擾動磁珠。

3. 輕彈或輕輕渦旋把磁珠重懸于 500 ul 裂解/結合緩沖液中。把磁珠留在緩沖液里直到準備把它加到細胞裂解液里。加到細胞裂解液里前移出磁珠。

4. 在一個 2 ml 的微量離心管里用 1ml 的裂解/結合緩沖液裂解 100 000 ～ 1000 000 個細胞（或 2～10 mg的組織），用組織勻漿器勻漿 1 min。如果有必要的話，最高速離心 1 min 去除細胞殘渣。使用勻漿器前，徹底清洗，再用 100％ 的乙醇淋洗，用 1L 的 DEPC 處理的雙蒸水洗滌。

5. 立刻用一個 1 ml 的注射器使裂解液通過一個 23-G 的針頭撕裂基因組 DNA 。把洗過的磁珠和裂解液混合，室溫用手連續晃動溫育 3～5 min。

6. 把管子放到磁座上 2 min，棄掉上清（上清可以保存用作 DNA 的實驗）。

7. 用一個 P200 帶濾芯的吸頭上下吹吸洗滌磁珠。按下面的順序洗滌：

7.1 1 ml 含20 ug/ml 糖原的洗滌緩沖液 A（1 ml 洗滌緩沖液中加入 1 ug 20 mg/ml 的糖原），兩次。

7.2 1 ml 含20 ug/ml 的糖原的洗滌緩沖液 B， —次。

7.3 200 ul 1× 第一鏈緩沖液混合液（用 DEPC 水從試劑盒中的 5× 第一鏈緩沖液混合液稀釋），4次。

8. 把磁珠重懸于下面的第一鏈合成混合液里：

54 ul DEPC ddH₂O

18 ul 5× 第一鏈緩沖液

9 ul 0.1 mol/L DTT

4.5 ul 10 mmol/L dNTP

把管子置于 37°C 2 min， 然后加入 3 ul 200 U/ul SuperScript II 逆轉錄酶。37°C 溫育 1 h， 每 10 min 用手混勻磁珠。把管子置于冰上中止反應。

9. 在冰上往第一鏈的反應里加入如下第二鏈合成的成分，次序如下：

227 ul ddH₂O， 預冷

150 ul 5× 第二鏈緩沖液

15 ul 10 mmol/L dNTP

3 ul 10 U/ul E.coli DNA 連接酶

12 ul 10 U/ul E.coli DNA 聚合酶 I

3 ul2 U/ul E.coli RNase H

16°C 溫育 2 h， 每 10 min 用手混勻磁珠。

10. 溫育后，把管子置于冰上加入 100 ml 0.2 mol/L EDTA 中止反應。

11. 用含 0.1％ SDS 和 2× 乙酰化 的 BSA 的 1×BW 緩沖液洗一次（ 如果不加 BSA ，珠子會變得很黏）。

12. 用 500 ul 含 2×BSA 的 1XBW 緩沖液洗 3 次。重懸在 500 ul 含 2×BSA 的 1×BW 緩沖液中，70°C 加熱 20 min 失活 Poll 的核酸酶活力。

13. 用 500 ul 含 2×BSA 的 1×BW 緩沖液洗 3 次。然后用 200 含 2×BSA 的 1×NEB 緩沖液4 （隨 NlaⅢ 提供）洗 2 次（第一次用 NEB 緩沖液/ BSA 洗完后轉移到一個新管里）。取 5 ul 最后的磁珠懸液，用已知存在于所要建庫 cDNA 中的基因引物，PCR 檢查 cDNA 的完整性

14. 把磁珠重懸于下面的混合液中：

171 ul LoTE 緩沖液

4 ul 100×BSA

420 ul 10×NEB 緩沖液 4

5 ul NlaⅢ

37°C 溫育 1 h。

15. 溫育后，把管子置于磁座上約 30 S，然后用下面的溶液和 P200 帶濾芯的吸頭上下吹吸幾次洗滌：

500 ul 含 1％ Tween 20 和 2×BSA 的 1×BW 緩沖液，2 次

500 ul 含 2×BSA 的 1×BW 緩沖液，4 次

200 ul 1×T4 DNA 連接酶緩沖液，2 次

最后重懸于連接酶緩沖液后，每個樣品轉移 100 ul 到 2 個新的硅烷化的微量離心管里。

16. 移棄最后的洗滌液，珠子重懸在下面的溶液里：

5 ul LoTE 緩沖液（兩管）

2 ul 5×T4 DNA 連接酶緩沖液（兩管）

3 ul 2 ng/ul 連接子 1A，B （已復性的；管 1）

3 ul 2 ng/ul 連接子 2A，B （已復性的；管 2）

17. 50°C 加熱管子 2 min 后置于室溫 5～10 min。每管中加入 1 ul 5 U/ul 高濃度 T4 DNA 連接酶，16°C 溫育 2 h。間歇混勻。

18. 連接后，置于磁座上約 30 s，然后每個樣品用 500 ul 含 0.1 ％ SDS 和 2×乙酰化的 BSA 的 1×BW 緩沖液洗兩次（第一次洗后合并管 1 和管 2，以減少后續步驟的損失）。

19. 用 500 ul 含 2×BSA 的 1×BW 緩沖液洗 4 次 ； 用 200 ul 含 2×BSA 的 1×NEB 緩沖液 4 洗兩次（第一次用 NEB 緩沖液/BSA 洗后，轉移到一個新的管里）。

20. 65°C 預熱下面的混合液 2，重懸起磁珠：

170 ul LoTE 緩沖液

4 ul 100×BSA

20 ul 10×NEB 緩沖液 4

2 ul BsmIII

65℃ 溫育 1 h，間歇混勻。

21. 溫育后，最高速離心 2 min， 然后轉移上清到一個新的 1.5 ml 的微量離心管。用 40 ul LoTE 緩沖液洗一次，最后終體積為 240 ml。

22. 用 240 ul PC8 抽提，用 4 ul SeeDNA 乙醇沉淀：

22.1 加入 4 ul SeeDNA ［或 4 ul 3：1 （V/V） 的糖原和 SeeDNA 混合物］

22.2 加入 0.1 倍體積 3 mol/L 乙酸鈉（24 ul）， 混勻

22.3 加入 2 倍體積的 100％ 乙醇（480 ul）， 混勻

22.4 室溫溫育 2 min

22.5 最高速離心 5 min

22.6 70％ 的乙醇洗兩次，最后一次洗完后再離心一次，用吸頭小心地移出并棄去殘余液體，重懸于 10 ul LoTE 緩沖液。

23. 加入下面的混合液：

30. 5 ul ddH₂O

5 ul 10×Klenow 緩沖液（或 Roche 緩沖液 H）

2.5 ul 10 mmol/L dNTP

1 ul 100×BSA

1 ul Klenow

37°C 溫育 30 min 后，加入 190 ul LoTE 緩沖液（240 ul 終體積）。

24. 用等體積（240 ul） 的 PC8 抽提。轉移 200 ul 到一個連接酶「＋」的管里，余下的 40 ul 到連接酶「-」的管里。

25. 用 2 ul SeeDNA、0.1 倍體積乙酸鈉和 2 倍體積的 100％ 乙醇沉淀。70％ 乙醇洗兩次，最后一次洗完后再離心一次，用吸頭小心移去殘余液體，晾干 5~10 min。重 懸于 2 ul LoTE 緩沖液。

26. 準備 2× 連接酶「＋」混合液：

2.5 ul 3 mmol/L Tris·Cl， pH 7.5

3.0 ul 5×T4 DNA 連接酶緩沖液

2.0 ul 5 U/ul 的高濃度 T4 DNA 連接酶

準備 2×連接酶「-」混合液：4.5 ul 3 mmol/L Tris ·Cl， pH 7.5 和 3.0 ul 5× T4 DNA 連接酶緩沖液。加入 2 ul 合適的混合液到＋/- 連接酶樣品里，在熱循環儀上 16°C 過夜（8～12 h）。

27. 連接后，加入 98 ul LoTE 緩沖液，優化 PCR 條件，然后進行大規模的 PCR 擴增。

28. 準備大規模 PCR 的反應混合液（2～3 個 96 孔板，每孔 50 ul 反應液），每個反應的成分如下：

5 ul 10×SAGE PCR 擴增緩沖液

3 ul DMSO

4.0～10 ul 10 mmol/L dNTP

1 ul 350 ng/ul PCR 引物 1

1 ul 350 ng/ul PCR 引物 2

用 ddH₂O 調整體積到 49 ul

0.7 ul 5 U/ul Platinum Taq DNA 聚合酶

每孔分裝入 49 ul 反應混合液，然后加入 1 ul 適當稀釋的模板。

29. 熱循環儀運行如下程序：

1 輪：

2 min 94°C

26～32 輪：

30 s 94°C（變性）

1 min 55°C（復性）

1 min 70°C（延伸）

1 輪：

5 min 70°C（終產物延伸）

連接酶「-」的樣品應當擴增 35 輪。

不要對 Platinum Taq DNA 聚合酶使用傳統的熱啟動 PCR。

30. 把 PCR 反應物混合到一個 50 ml 的錐形管里，用 LoTE 緩沖液擴大體積到 11.5 ml， 然后用等體積的 PC8 抽提。

31. 乙醇沉淀：

11.5 ml 樣品

10 ul SeeDNA

100 ul 糖原

5.1 ml 7.5 mol/L 乙酸銨

38.3 ml 100％ 乙醇

干冰/甲醇浴 15 min。然后室溫溶化 2 min。

32. 輕輕渦旋混勻，臺式離心機的吊桶轉子室溫約 3000 g （4000 r/min） 離心 30 min。

33. 用 5 ml 70％ 的乙醇禍旋，洗漆，吊桶轉子約 3000 g 室溫離心 5 min。

34. 沉淀重懸于 216 ul LoTE 緩沖液。加入 54 ul 5× 上樣緩沖液（終體積 270 ul）。

35. 3 個 20％ 聚丙烯酰胺/TBE 凝膠，每孔上樣 10 ul。在 27 個泳道用加長的吸頭上樣，每個加 10 ul （不要過載）。每塊凝膠加 10 ul 20 bp 序列階梯作分子質量參照物。

36. 160 V 電泳 90 min 到距凝膠底約 1 cm，使 103 bp 的雙標簽片段和 80 bp 的連接子-連接子二者盡可能分開。

37. 在一個用錫箔包好的容器里染凝膠，50 ml TBE 緩沖液中加入 2～5 ul SYBR Green I。讓凝膠在水平搖床上浸泡 15 min， 在用 SYBR Green I 或 UV 濾鏡的 UV 盒上 觀察。

38. 從凝膠上只割出擴增的帶雙標簽的產物，把 3 個割出的凝膠放在硅烷化的 0.5 ml 離心管里（總共 9 個 0.5 ml 的管子），這些管子的底部都有一個直徑約 0.5 mm 的 小孔（用 21-G 針頭刺的）。

39. 把 0.5 ml 的離心管放在 2.0 ml 的硅烷化的離心管里，最高速離心 4 min （這樣可以使聚丙烯酰胺凝膠打碎成小塊，收集在 2.0 ml 的管底）。

40. 扔掉 0.5 ml 的離心管。每個 2.0 ml 離心管中加入 250 ul LoTE 緩沖液和 50 ul 7.5 mol/L 的乙酸銨。

41. 渦旋每個管子，然后置 65°C 15 min。在 18 個 Spin-X 離心管的濾膜上各加 5 ul LoTE 緩沖液。

42. 把每個管里的溶液轉移到 2 個 Spin-X 的離心管濾膜上（即 9 管轉移到 18 個 Spin-X 的離心管濾膜上）。最高速離心 5 min。合并兩份洗脫液（總共 300 ul），轉移到 1.5 ml 的微量離心管里。有時，純化的 102 bp 的條帶不能被 NlaIII 重新切開，這可能和純化得不干凈有關。如果出現這種問題，把 300 ul 洗脫液通過 Qiaquick 凝膠抽提方案抽提一次，終體積調回到 300 ul。

43. 洗脫液進行乙醇沉淀：

300 ul 樣品

0.5 ul SeeDNA

1.5 ul 糖原

133 ul 7.5 mol/L 乙酸銨

1000 ul100％ 乙醇

渦旋，置于干冰/甲醇浴 15 min。室溫 2 min 使融化，然后 4°C 離心 15 min。

44. 最高速離心 15 min。75％ 的乙醇洗兩次。每管 DNA 重懸于 10 ul LoTE 緩沖液。 混合樣品到一個管里（總量 90 ul）。

45. 用 NlaIII 消化 DNA：

90 ul LoTE 緩沖液中的 PCR 產物

226 ul LoTE 緩沖液

440 ul 10×NEB 緩沖液 4

4 ul 100×BSA

40 ul 10 U/ul NlaIII

37°C 溫育 1 h。

46. 用等體積的 PC8 抽提。混合水相轉移到 1.5 ml 微量離心管。在干冰上乙醇沉淀：

200 ul 樣品

66 ul 7.5 mol/L 乙酸銨

3 ul SeeDNA

825 ul 100％ 乙醇

渦旋混勻，置于干冰/甲醇浴 15 min。

47. 室溫 2 min 使融化，然后 4°C 離心 15 min。

48. 冷的 75％ 乙醇洗一次，用細頭的吸頭吸掉殘余的乙醇。重懸沉淀于 40 ul LoTE 緩沖液。在冰上加入 5× 上樣緩沖液（總共 50 ul）。

49. 把樣品加到一個 20％ 聚丙烯酰胺凝膠的 4 個泳道中，隔開一個泳道加上 20 bp 序列階梯作為分子質量參照物，160 V 電泳 2.5 h。用 1：10 000 的 SYBR Green I 染 15 min。

50. 在長波 UV 照射下切出 24～26 bp 的條帶，每兩個條帶放到一個底部有約 0.5 mm 小洞的 0.5 ml 的微量離心管中（用 21-G 針頭刺的）。

51. 把管子放在 2.0 ml 的硅烷化的離心管里，最高速離心 2 min。

52. 扔掉 0.5 ml 的離心管。每個 2.0 ml 離心管中加入 250 ul LoTE 緩沖液和 50 ul 7.5 mol/L 的乙酸銨。渦旋每個管子，然后置于 37°C15 min。不要在 65°C 溫育。這會使得 26 bp 片段變性。可以溫育更長一點的時間（甚至過夜），但看起來并不會顯著提高產量。

53. 用 Spin-X 離心管濾膜按步驟 42 方法分離洗脫液。分在 3 個管里（每個 200 ul ） 進行乙醇沉淀：

200 ul 樣品

66 ul 7.5 mol/L 乙酸錢

2 ul SeeDNA

3 ul 糖原

825 ul 100％ 乙醇

置于干冰/甲醇浴 10 min， 然后 4°C 離心 15 min。

54. 用冷的 75％ 乙醇洗兩次。每個 DNA 樣品重懸于 2.5 ul 冷的 LoTE 緩沖液（總共 7.5 ul）。在加入連接緩沖液前使純化的雙標簽片段保持在冰上很重要。高 AT 含量的小片段即使在 LoTE 緩沖液中，室溫下也會變性。

55. 混合下面的試劑：

7 ul 混合的雙標簽 DNA

2 ul 5×連接緩沖液

1ul 5 U/ul高濃度 T4 DNA 連接酶

16°C 溫育 1～3 h。

不要連接過夜，因為這樣會使得串聯產物很長而難于克隆。

56. 連接完成后，加入 2.5 ul 5×上樣緩沖液。65°C 加熱樣品 5 min，立刻置于冰上。

57. 在 10％～12％ 的聚丙烯酰胺/TBE 凝膠上分離串聯體。在第一個泳道里加上 1 kb 的分子質量參照物，隔一個泳道把串聯的樣品全部加到第 3 個孔里。200 V 電泳 45 min。

58. 用 1：10 000 的 SYBR Green I 染 15 min。在 UV 盒上觀察，分出感興趣的區帶。

59. 把每一塊凝膠放入底部有約 0.5 mm 小洞的 0.5 ml 微量離心管中（用 21-G 針頭刺的）。

60. 把 0.5 離心管連同凝膠塊放入 2.0 ml 的硅烷化的離心管里，最高速離心 2 min， 把聚丙烯酰胺凝膠打碎成小塊，收集在 2.0 ml 的管底。

61. 扔掉 0.5 ml 的離心管。2.0 ml 離心管中加入 300 ul LoTE 緩沖液。渦旋每個管子，然后置于 37°C 15 min。

62. 把每個管里的東西轉移到 2 個 Spin-X 的離心管濾膜上（總共 4 個 Spin-X 管子）， 最高速離心 5 min。

63. 每兩個 Spin-X 管子的洗脫液合并在一個 1.5 ml 離心管中，加入乙醇進行沉淀：

300 ul 洗脫液

2 ul SeeDNA

133 ul 7.5 mol/L 乙酸銨

1000 ul 100% 的乙醇

64. 最高速離心 15 min。70% 乙醇洗兩次，晾干 5 min。純化的串聯 DNA 重懸于 6 ul LoTE 緩沖液。

65. 在10 ul 的體系里，用 SphI 消化 1 ug pZErO-1 質粒：

1 ul pZErO-1 質粒

7 ulddH₂O

1 ul 10×NEB 緩沖液 2

1 ul SphI

37°C 溫育 15～30 min, 然后　65°C 加熱 10 min 滅活。不要消化超過 30 min。

66. 瓊脂糖凝膠電泳檢查消化是否完全。用 90 ul pH 8.0 的 TE 稀釋切好的載體，然后用等體積 PC8 抽提。乙醇沉淀，75% 乙醇洗滌 2 次，重懸于 40 ul 水或 TE 緩沖液中（約 25 ng/ul 載體）。

67. 混合下面的連接反應液，同時配制一份不加串聯體的對照反應：

6 ul 純化的串聯體（對照中不加）

1.5 ul dH₂O （對照中 7.5 ul）

1 ul 25 ng/ul SphiI 切好的 pZErO 質粒

1 ul 10×T4 DNA 連接酶緩沖液

0.5 ul 4 U/V 的 T4 DNA 連接酶

16°C 溫育 2 h。

pZErO質粒的廠商提醒如果溫育時間長于 1 h 會使背景增高，原因可能是 ccdB 死亡基因上自然發生的突變。

68. 用 LoTE 緩沖液把樣品調整到 200 ul 用等體積的 PC8 抽提，然后乙醇沉淀：

200 ul 樣品

133 ul 7.5 mol/L 乙酸銨

2 ul SeeDNA

777 ul 100% 的乙醇

69. 70% 乙醇洗 4 次。最高速快速離心，棄去 70% 乙醇，晾干 5 min。重懸于 10 ul LoTE 緩沖液。