目的
帶有特定基因的質體在分子生物研究上，是一個很重要的工具，將質體送入細菌的過程稱為基因轉形，經由基因轉型可使質體在細菌中大量復制，以備進一步研究。本實驗將把你在前面轉殖實驗中cDNA和質體DNA的連結反應送入細菌。 你將從本實驗學習如何進行基因轉型作用。
原理
早在1970年左右，有人發現細菌經由冰冷的CaCl2處理后，可以轉染(transfect)噬菌體凹后來發現同樣的方法可以用來轉型質體及大腸桿菌染色體DNA。可見經由CaCl2處理后的大腸桿菌勝任細胞(competent cell)，具有納入DNA的能力，雖然機制仍然不清楚，但是此方法卻在實驗室中被廣泛使用。本實驗是先將大腸桿菌以CaCl2處理成勝任細胞，再加入帶有抗ampicillin基因的質體，以使其納入大腸桿菌中。 42 oC 的熱休克作用有助于提高基因轉型作用的效率，再經由一段恢復期后，就可以生長在含ampicillin的培養基上以便篩選。此方法的轉型效率為每g的supercoiled DNA可產生5x106至2x107個轉型菌株。
材料
E. coli strain DH5
LB培養液：每公升含10 g tryptone，5 g yeast extract，5 g NaCl
LB固體培養基：配方如LB培養液，加上15 g agar，高壓滅菌后讓其冷卻至約50 oC，視需要加入抗生素、IPTG、X-Gal等，立即倒入培養皿內，待其固化。
50 mM CaCl2溶液
100 mg/ml ampicillin
操作步驟
1. 將作為宿主(host)的大腸桿菌DH5，于2 ml LB培養液中做隔夜培養。
2. 第二天，取0.2 ml的飽和菌液加入10 ml LB培養液，于37 oC 200 rpm搖晃培養至菌液的OD600為0.4，約1小時。
3. 將菌液倒入15 ml離心管中，在2,500 g下離心5分鐘，倒掉上清液。 菌液沈淀則以5 ml冰過的50 mM CaCl2溶液回溶，并靜置冰上30分鐘。 經由CaCl2處理過的細菌變得較脆弱，故以下操作勿太激烈且在冰上進行。
4. 再度在2,500 g下離心5分鐘，倒掉上清液。 菌液沈淀則以0.5 ml冰過的50 mM CaCl2溶液小心回溶，此時已完成勝任細胞的制備。
5. 取適量的質體DNA與200 l的勝任細胞混合后，置于冰上30分鐘。期間每5-10分鐘拍打混合物一次，以防止菌液沈淀。
6. 放入42 oC水浴2分鐘熱休克處理后，立即放回冰上。
7. 加入1 ml LB培養液，于37 oC 200 rpm搖晃培養1小時進行恢復。
8. 取已完成基因轉型作用的菌液，以推棒均勻涂抹于含100 g/ml ampicillin, 0.5 mM IPTG, 40 g/ml X-Gal的LB固體培養基上，每個培養基含10 l至400 l 的菌液，做隔夜培養。長出的單一菌株，可用于進一步的篩選。
結果及討論
1. 計算培養基上菌落的數目。 請說明你如何從轉型效率來判斷所制備之勝任細胞是否成功。
2. 你所得之菌落中，藍色及白色的比例為何？ 請解釋它的意義。
3. 其它你認為值得討論之發現。
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質體DNA的少量制備和限制脢切割分析
目的
帶有特定基因的質體在分子生物研究上，是一個很重要的工具，因而必需先將質體自細菌中抽出，以備進一步研究。本實驗將從你在前面轉型實驗所得到的細菌中，抽取質體DNA，再進行限制脢切割分析，以確定DNA的選殖成功。你將從本實驗中學習如何自細菌中少量制備(mini-preps)質體DNA及進行限制脢切割分析。
原理
本實驗所采用之質體DNA少量制備的方法為堿溶解法(alkaline lysis method)。以含有SDS及NaOH的溶液將細菌溶解，SDS會使蛋白質變性，而NaOH則使染色體及質體DNA變性。環形質體DNA因拓樸纏繞之故，其兩股DNA并不會游離，當以酸性之potassium acetate溶液去中和反應時會很快地再度黏合。同時，potassium acetate也會使染色體DNA、大分子RNA、蛋白質及SDS均形成沉淀，而能以離心去除。 Phenol/chloroform則可進一步萃取掉殘存的蛋白質。 質體DNA則以酒精沉淀加以濃縮。如此得到之少量制備的質體DNA可以限制脢切割，再于瓊膠電泳分析分子量以確認之。通常，一些high-copy-number的質體，如pUC，每ml的飽和菌液可以抽得3-5 g的DNA分子。
材料
LB培養液：每公升含10 g tryptone，5 g yeast extract，5 g NaCl
100 mg/ml ampicillin
NaOH/SDS solution：0.2 N NaOH，1% sodium dodecyl sulfate
Potassium acetate solution：溶解29.6 g potassium acetate于約80 ml的蒸餾水中，以glacial acetic acid調至pH 4.8 (約需11.5 ml)，再加水至總體積為100 ml。
Phenol/chloroform 1:1
95%, 70% ethanol
10X EcoRI buffer：500 mM NaCl，1M Tris-HCl (pH 7.5)，100 mM MgCl2，0.25% Triton X-100
10 mg/ml RNase A
EcoRI：20 units/l，購自New England BioLabs公司
10X loading buffer：20% Ficoll 400，0.25% Bromophenol blue，0.25% Xylene cyanol
2% agarose gel：稱取2 g agarose，加入100 ml的1X TAE buffer，以微波爐煮沸至溶解，待其冷卻至約60℃后倒入膠體形成盒內。將齒梳插上，靜置30-50分鐘。 小心將齒梳取下，放入電泳槽內，加入1X TAE buffer使之淹過膠體。
50X TAE electrophoresis buffer：每liter含有242 g Tris base，57.1 ml glacial acetic acid，100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)
操作步驟
(一)質體DNA的少量制備：
1. 從實驗五之培養基上挑取白色菌株，種于含有100 g/ml ampicillin的LB培養液中，做隔夜培養。
2. 第二天，取1.5 ml飽和菌液放入微量離心管中，以12,000 rpm離心30秒，倒掉上清液，并以微量吸管吸掉殘留的菌液。
3. 加入100 l的TE，劇烈震蕩30秒以將菌液沈淀完全回溶。
4. 加入200 l NaOH/SDS solution，上下顛倒搖動多次以充分混和。置于冰上5分鐘。 此時因細菌溶解，菌液會由混濁變澄清而稍黏。
5. 加入150 l potassium acetate solution，上下顛倒搖動多次混和均勻后，會產生白色懸浮顆粒。
6. 于12,000 rpm離心5分鐘后，用牙簽挑掉白色沈淀。
7. 加入等體積(約400 l) phenol/cholroform 1:1，劇烈震蕩30秒。 于12,000 rpm離心1分鐘后，以微量吸管小心吸取上層水層至另一微量離心管中，切勿取到界面的白色蛋白質沉淀。
8. 加入2.5倍體積之95% ethanol，置于室溫2分鐘以沈淀DNA。
9. 于12,000 rpm離心10分鐘后，小心倒掉上清液，留下底部少量的DNA白色沈淀。
10. 加入1 ml 70% ethanol，上下顛倒搖動多次以清洗。
11. 以12,000 rpm離心3分鐘后，小心倒掉上清液，留下底部少量的DNA白色沈淀。并在干凈衛生紙上盡可能吸掉殘留的酒精。
12. 真空抽干后，最后加入20 l TE，以微量吸管吸沖多次，以使DNA白色沈淀完全回溶。
(二)限制脢切割分析：
1. 于微量離心管中加入以下物質，并完成混合：
蒸餾水 2 l
10X EcoRI buffer 1 l
RNase A (0.2 mg/ml) 1 l
少量制備之質體DNA 5 l
EcoRI (10 units/l) 1 l
2. 置于37 oC水浴，2小時。
3. 加入1 l 10X loading buffer，混合后加載2%瓊膠，進行電泳。
4. 電泳后，將瓊膠置于紫外光箱上觀察，以確定是否選殖出建構完成之質體。
結果及討論
1. 請估計你少量制備之質體DNA的總量。
2. 說明你的限制脢切割分析結果，并解釋如何判斷你已選殖到所欲建構之質體DNA。
3. 其它你認為值得討論之發現。