二．血細胞染色法
（一）細胞染色機理：染色是將細胞經染色劑的物理及化學作用，使其清楚顯示細胞各個組成部分，有利辨識細胞形態。
●染色可分二個步驟：
1．染料受相應物質吸附而附著于物質表面；
2．固著作用：
○即染色粒子進入細胞內起化學反應（染料透過細胞膜的學說很 多，尚無定論），與相應的物質形成溶解度很低的鹽固著于細胞內而顯色。
○染色劑皆有選擇作用，其染色不是將細胞全部一齊著色，而只是將其中一部分染色，多余的被沖洗掉。目前多以吸附學說（電力吸附、機械吸附、化學吸附）來解釋。
●一般染色方法由兩種染色劑（酸性、堿性）組成，通常細胞核及漿堿性粒體為堿性，細胞漿為酸性。
○酸性染料可和帶正電荷的（堿性）物質結合，這種物質稱嗜酸性物質，對酸性染料具有親和力，因此嗜酸性粒細胞之顆粒本身為堿性物質；
○堿性染料可和帶負電荷的（酸性）物質相結合，這種物質稱嗜堿性物質，對堿性染色粒具有親和力。
○另一種蛋白質在pH6.4 呈等電狀態，本身所含的正/負電荷相等，既能和酸性染料又能和堿性染料結合，這種物質稱中性物質，如中性粒細胞之顆粒。
●一般用pH6.4 PBS 來稀釋染液：
○在恒定條件下著色，使染色效果趨于一致。
○染液過堿時，蛋白質帶有負電荷，對次甲藍有色部分的正電荷吸附力強染成的細胞一般著色較藍，說明pH不適合。
●染色與固定亦有極大關系：
○因細胞經固定后，其蛋白質的電力吸附（電附）可能有變化，有些固定液能將細胞某部分的電附加強，使其染色更為容易。
○伊紅與胞核雖無電附仍有機械吸附，能染上少量紅色，蘇木液與胞漿雖無電附但也有機械吸附，因而胞漿略顯藍色。
●血細胞的染色多采用瑞氏染色和姬姆薩染色兩種，
○作者取其兩種染色的優點，采用瑞氏和姬姆薩混合染色法，比單用一種染色法更佳。
○一些快速和改良染色方法及染色液商品化，對血細胞形態染色不一定適用。
（二）瑞氏（Wright's staim；美藍－伊紅Ｙ）染色：
1．瑞氏染料是由堿性染料美藍（Methvlem blue）和酸性染料黃色伊紅（Eostm Y）合稱伊紅美藍染料即瑞氏（美藍－伊紅Ｙ）染料。
2．用甲醇作瑞氏染料溶劑，即成瑞氏染液。甲醇是瑞氏染料良好溶劑，有兩種作用：
（1）甲醇使瑞氏染料中美藍（M）與伊紅（E）在溶液中離解，可使細胞成分選擇性吸附其中的有色物質而著色。
甲 醇
ME（瑞氏染料）----→M+ + E-
在配制的瑞氏染液中美藍如放置過久即可氧化而含有天青，美藍天青與伊紅化合物能使核染成紫紅色，但不能使胞漿染為藍色，多余美藍就可以使胞漿染成藍色，染色主要是化學作用，是離子彼此結合的反應。
（2）甲醇具有強大的脫水力，可將細胞固定在一定形態及增加細胞結構的表面積，提高細胞對染料吸收作用，同時由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升溫，加速染色反應。
3.瑞氏染液配制：
(1) 瑞氏染液配制：
瑞氏染料 830gm或1g
甲醇（AR） 500ml或600ml
○先稱干燥（事先放入溫箱干燥過夜）瑞氏染料放置乳缽內，用乳棒輕輕敲碎染料成粉末，再行研磨至聽不到研芝麻聲即呈細粉末，加少許甘油或甲醇溶解研磨，使染料在乳缸內顯“一面鏡”光澤，而無染料粉粒沉著。
○再加較多量甲醇研磨呈一面鏡光亮，靜置片刻，將上層液體倒入一清潔儲存瓶內（最好用甲醇空瓶），再加甲醇研磨，重復數次，至乳缽內染料及甲醇用完為止，搖勻，密封瓶口。
○存室溫暗處，儲存愈久，則染料溶解、分解就越好，一般儲存3個月以上為佳。
(2) 緩沖液：
●緩沖液作用：
○染色對氫離子濃度是十分敏感的，據觀察pH值的改變，可使蛋白質與染料形成的化合物重新離解。
○緩沖液須保持一定的pH使染色穩定，PBS的pH 一般在6.4~6.8，
○偏堿性染料可與緩沖液中酸基起中和作用，偏酸性染料則與緩沖液中的堿基起中和作用，使pH恒定。
●緩沖液配制（pH6.4~6.8，弱酸性）：
配方1 ： 配方2：
1% KH2PO4 30ml M/15 KH2PO4 73.5 ml
1% Na2HPO4 20ml M/15 Na2HPO4 26.5ml
H2O(新鮮) 加至1000ml
置室溫黑暗處，瓶口密封，防止霉菌污染，如有污染則應報廢。
（三）姬姆薩（Giemsa's stain；天青-伊紅）染色
1．姬姆薩染料是伊紅(AzurII Eqsin)和天青（藍）2號合成的。
2．姬姆薩染料（ Giemsa, 天青-伊紅）染液配制：
姬姆薩染料（粉末） 0.5g或7.5g
甲醇（AR） 33ml 或500ml
甘油（AR） 33ml或 500ml
●先將姬姆薩染料放入乳缽中，逐漸倒甘油研磨溶于甘油中，置于56℃水溫箱內，90～120分鐘，然后加入甲醇，搖勻后放置數天，過濾后或不過濾即可使用。此染液放置室溫陰暗處，時間越長越好。
●使用染液可臨時配置）：姬姆薩染液1ml，加DDH2O10ml混勻。即可使用。
3．染色步驟：
（1）先用甲醇固定2～3分鐘。
（2）將血或骨髓涂片放置姬姆薩使用液15～30分鐘。
（3）涂片用自來水沖洗，在室溫中干燥待查。
（四）瑞氏或姬姆薩染色液鑒定：剛配好或放置一個月以上的染液可進行下列鑒定：
1．取1滴染液于乳白玻板上，自行迅速擴散開，其顏色變紫紅色，且有偽足形成。
2．取1滴染液加1滴緩沖液，染液由深藍色立即變為紫紅色。
3．取血片或骨髓片進行試染檢查，觀察染色后各類細胞的胞核、胞漿及顆粒著色情況，pH是否合適及染色合適時間。如有上述變化，表明染液合格，可供使用。
（五）瑞氏染色(Wright's)-姬姆薩（Giemsa's）混合染色：
●瑞氏染色的染料配方濃度對細胞核著色程度適中,細胞核結構和色澤清晰艷麗,對核結構的識別較佳,但對胞漿著色偏酸,色澤偏紅,對細胞漿內顆粒特別是嗜天青顆粒及嗜中性顆粒著色較差。
●姬姆薩染色對胞漿著色能較好的顯示胞漿的嗜堿性程度,特別對嗜天青、嗜酸性、嗜堿性顆粒著色較清晰, 色澤純正,而對胞核著色偏深,核結構顯示較差。
●故采用以瑞氏染液為主，姬姆薩染液為輔的混合染色。
染色步驟:
1. 先用瑞氏染液將涂膜面充分覆蓋；
2. 稍等片刻再加姬姆薩染液2-3滴加減(根據涂片上細胞多少及增升程度酌情而定)；
3. 稍等1-2分鐘后,再加磷酸鹽緩沖液,加時應緩慢地一滴一滴加在涂片膜上,直至膜面上染色液形成表面張力而終止染色液加入；
4. 染色30-40分鐘；
5. 分色：用自來水緩緩沖洗至少3分鐘以上,待干，勿用濾紙吸干,以免濾紙纖維污染涂片。
三．形態學與血液檢查與自身特性
（一）血常規
（二）白細胞分類
（三）骨髓外周血細胞形態學及分類
（四）血細胞涂片特性
（一）血常規檢查（Hb、RBC、WBC、PIT、血細胞比積、RBC-MCV、MCH、MCHC及血小板容積曲線）
●用自動化儀器提高工作效率，
●為使結果準確可靠，必須建立監測方法，搞好質控，此屬數值質控。
●我國已較普遍開展全國、省、市（地區）質控。但普遍存在應付質控質量的問題，并未能切實解決自身質控問題。
（二）白細胞分類：
●白細胞分類的自動化已普遍應用，只能為患者普查與篩選之用。遇有問題應用顯微鏡觀察，彌補自動化儀器缺陷。
●一般醫院顯微鏡檔次偏低，分辨率低，維修和正確使用欠缺，提高顯微鏡檔次更好地發揮光鏡的觀察效應。
（三）骨髓及外周血細胞形態學及分類：
●是血液病臨床診斷的依據及臨床各科患者基本檢查可反映原發性疾病的繼發性血液學病理改變。
●臨床血細胞形態學診斷檢查的程序和內容應包括臨床資料（血常規）初步診斷內容及血細胞形態學（骨髓外周血）。
●必要時還要做細胞化學染色骨髓組織病理學等檢查的完整概念。
（四）血細胞涂片自身的特性：
1．涂片不易均勻：由于血液是混懸液，其中白細胞、RBC、血小板的形態大小、比重及生物活性和血漿成分等的不同和制片技術差異、細胞分布不均勻性差異頗大。
2．細胞分布與分類的非隨機性：
● 細胞分類標準與觀念不一；
● 采樣和計數100~200個白細胞的局限性；
● 細胞分布的生理變動；
3. 與疾病的相關性；
4. 形態學質控：
●室內、室間分類不一致性，開展室間質控也是促進形態學質量穩定的一種手段。
●自1983年以來，澳大利亞皇家病理學質控中心和英國皇家進修學院WHO質控中心及最近美國洛杉磯質控中心，國內：全國及省地市也普遍開展，由質控標本涂片發展圖片指定細胞識別。
●必須健全診斷報告審核制度、專業進修、講習班、讀片研討會等學術交流，是提高形態學診斷質量的保障。