外源DNA片段在質粒載體中的克隆實驗原理和步驟

DNA重組技術包括載體及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的獲得及純化、目的片段與克隆載體的體外連接、重組子的篩選和鑒定等內容。DNA片段的克隆技術是分子操作的核心部分。

實驗目的：
學習DNA的酶切、純化及外源片段與載體的連接，將BAC克隆所攜帶的外源DNA酶切片段亞克隆到pUC18載體上。

實驗材料：
外源片段來自一個含有水稻DNA片段的BAC克隆的酶切片段；克隆載體為PUC18。

實驗原理：
限制性內切酶可識別特定位點并切割DNA產生粘性末端或平端的外源片段，經DNA的純化處理后用于連接反應；選擇克隆載體pUC18多克隆位點上相應的限制性內切酶切割，并用堿性磷酸酶處理防止載體自連；在連接酶的作用下將外源片段連接到載體上，實現外源片段的克隆。

實驗步驟：
1．載體pUC18和外源DNA片段的限制性酶切：
（50 ml反應體系，用1.5ml tube，冰上操作）：
DNA 30 ml
R.E 1 ml
10×buffer 5 ml
ddH2O 14 ml
37℃反應1hr，分別取8 ml 外源片段酶切產物和5 ml PUC18酶切產物于1.0%凝膠檢測酶切是否完全；按2－5步純化、回收DNA
2．加入ddH2O 150 ml （擴大體積），加入等體積氯仿/異戊醇（24:1），顛倒混勻，12000g離心10 min；
3．吸取上清，加1/10體積3M NaAc和兩倍體積無水乙醇，-20℃放置15分鐘以上；
4．12000g 4℃冷凍離心15分鐘；
5．倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，風干后外源DNA溶于10 ml ddH2O（0.5ml tube中），PUC18溶于20 ml ddH2O（1.5ml tube中）；
6．按以下反應去除載體PUC18的5’磷酸基團，50℃反應30 min 以上
DNA 20 ml
CIAP（TaKaRa） 0.5 ml
10 ′ buffer 4.0 ml
ddH2O 15.5 ml

附注：
1. 根據試驗目的和外源片段的不同可選用不同的載體，采用不同粘性末端的雙酶切可實現外源片段的定向克隆。
2.克隆中用到的幾種工具酶：
（1）限制性內切酶
限制性內切酶的一個活性單位（1U）：指在50 ml反應體系中，37℃下，經過1小時的反應將1mg DNA完全切割所需要的酶量。
限制性內切酶的star活性：限制酶在某些條件下使用時對DNA切割的位點特異性可能降低，即可以切割與原來識別的特定DNA序列不同的堿基序列，這種現象叫限制酶的star活性。它的出現與限制酶、底物DNA以及反應條件有關。
（2）堿性磷酸酶
細菌堿性磷酸酶（BAP）和牛小腸堿性磷酸酶（CIAP）都能催化水解DNA、RNA、dNTP和NTP上的5’－磷酸殘基。比較而言，CIAP更常用，因其可在70℃ 10’內加熱滅活或通過苯酚抽提而變性失活，同時CIAP的活性比BAP的高10－20倍。它主要用于：（1）克隆時去除載體的5’-P，以防載體自連；（2）在用 Kinase進行5’末端標記前，去除DNA的5’-P。
（3）連接酶
體外催化磷酸二酯鍵的形成可使用兩種酶：大腸桿菌連接酶和T4噬菌體連接酶，但幾乎在所有的克隆中T4噬菌體連接酶都是首選的酶，因其能在正常的反應條件下能有效的將平端連接起來。
3. 氯仿對眼睛、皮膚、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌劑并可損傷肝臟和腎臟，操作時需戴手套、安全鏡并在通風櫥中進行。苯酚是強腐蝕劑，能引起嚴重燒傷。操作時應戴手套、安全鏡、穿防護服，并在通風櫥中進行。