多克隆抗血清的制備

材 料（帶 V 項 目 見 附 錄 1)

家兔、大鼠、小鼠或合適品系的倉鼠

弗 氏 完 全 佐 劑（CFA; Sigma)

含 1?2 mg/m l 純化蛋白抗原的 PBS 溶液：吸取其中 10?20 Mg，在考馬斯亮藍染色的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分析未見有污染的條帶VPBS

弗 氏 不 完 全 佐 劑（ incomplete Freunds adjuvant， IFA; Sigma)

50 ml —次性聚丙烯離心管

帶 有 19 G、 21 G 和 22 G 針 頭 的 3 ml 玻璃注射器

雙頭同步注射針座連接器或塑料 3 通道旋塞

IOOml 燒杯

1.取一只家兔、大鼠、小鼠或適用于免疫的倉鼠，采血并用 50m l 離 心 管 收 集 血 樣（見附 錄 2F)。從血樣中制備血清，檢 測 后 儲 存（見輔助方案）。

2.振 蕩 CFA 使 不 溶 的 結 核 分 枝 桿 菌 分 散 。 4°C 下 加 2 ml C F A 至 2m l 的 含 0.25?0.5 mg/m l 純化蛋白抗原的 PBS 溶 液（足 夠 免 疫 4 只 家 兔 或 8 0 只小鼠）。注意不要使 用 Tris 堿緩沖液制備乳化液。

3.將 CFA 和抗原混合物吸入帶有 19 G 針 頭 的 3 ml 玻 璃 注 射 器（不用塑料注射器）。取下針頭，盡可能排出空氣，把注射器接到一個雙頭同步注射針座連接器或一個塑料 3通 道 旋 塞 上（圖 1.2.1)。將一個空的 3 ml 玻璃注射器接到另一頭并且推壓使混合物在兩個注射器之間反復來回流動。將其置于冰塊上降溫，使混合物的溫度盡可能時刻保持在 4°C 左右。當混合物變為單相且轉為白色時，取下連接器或旋塞，接上一個21 G 的針頭，從混合物中擠出一小滴使其落到 IOOml 燒 杯 中 的 50m l 的冷水表面上，由此來檢測乳狀液是否穩定。如果乳狀液在水面上聚成一滴，則 按 步 驟 4 繼續進行。如液滴分散，繼續混合至乳狀液形成。

4.轉移全部佐劑-抗原乳狀液至某一注射器中，取下連接器和旋塞。在注射器上接一個22 G 的針頭并趕走氣泡。

5 . 固 定 住 動 物（附 錄 2 0 , 分別以肌內、皮內或皮下多部位注射方式給動物注射乳狀液（附 錄 2E)。對于小鼠，應使用腹腔注射。如果該抗原效果良好，則 將 其 在 4°C 下保存數周，使用之前將其重新乳化，否則棄去未使用的免疫原。

6.對動物免疫 10?14d 后 ，進行采血并收集血樣，制備血清并檢測。

7.制備抗原以增強免疫（步 驟 2?4)。當 CFA 作為初級免疫的佐劑時，使 用 IFA 作為所有后繼免疫的佐劑。在免疫之后，于 4 ?8 周 （或 在 第 2 周 ；圖 1.2. 2 ) 進行初次增強免疫， 7?14d 后對動物采血并收集血樣，制備血清并檢測。

8.每 隔 2?3 周進行進一步增強免疫，注意避免會導致皮膚潰瘍的反復皮內免疫。初次皮內或皮下免疫后，對家兔肌內注射以增強免疫。也可初次肌內注射免疫，增強免疫在其他部位進行。

9 . 每次增強免疫 10?14d 后對動物采血并收集血樣，制備血清并檢測。