多糖溶解度的測定

質量研究一般來講，多糖的質量研究主要包括各組分的理化性質如溶解度、比旋度和粘度的測定，分子量及分子量分布的研究，平面和立體的化學結構分析，結構改造和結構修飾的研究，以及糖醛酸、蛋白質、單糖和多糖的含量測定等等。下面簡單介紹多糖的結構、分子量及分子量分布以及含量測定等方面的研究進展。 1、結構分析目前在多糖一級結構的分析中大多采用化學方法與物理方法相結合,可基本闡明某一多糖的一級結構的大致特征。而目前用于多糖高級結構分析的方法主要是物理方法, 諸如 X-射線纖維衍射、核磁共振、電子衍射等。如上所述，多糖的一級結構本身就很復雜。由于多糖結構的微觀不均一性, 或結構鍵中有缺陷, 或是分子量分散, 使多糖的一級結構分析難以得出完全正確的結構式。多糖結構的描述包括:①多糖的分子量范圍；②多糖的單糖組分；③單糖的連接點類型；④單糖和糖苷鍵的構型；⑤重復單位。多糖的活性與其初級和高級結構密切相關,高級結構在活性方面比一級結構起更大作用。有些多糖一級結構相同, 但活性不同, 其原因是二級及三級結構不同。目前多糖的立體結構研究一般靠 2D-NMR及X-衍射法。除此之外, 多糖的活性還與分子量、溶解度、粘度等理化性質有關。在研究多糖的構效關系時, 常用到多糖的分子修飾, 對多糖進行化學修飾,如硫酸化、脫硫酸化、化學降解、酶降解、乙酰化、烷基化等等, 有助于深入探討其構效關系。下面將簡單介紹化學方法和物理分析方法。（1）化學方法測定多糖結構還是目前最常用的方法，測定的手段很多，其中經典而有效的是甲基化分析、高碘酸氧化和Smith降解、部分酸水解以及乙酰解和甲醇解等。 ①甲基化分析 甲基化分析是多糖也是寡糖結構分析的最有力的手段之一。它包括糖的所有自由羥基全部生成甲醚，接著通過水解釋放出甲基化單糖，再經NaBH4還原成糖醇，進而乙酰化水解后生成的羥基，得到各種部分甲基化的糖醇乙酰衍生物，生成的產物用氣相色譜進行定性和定量分析，可確定組成多糖的各單糖種類和比例，進而用氣相色譜—質譜，結合標準譜圖的分析，可得到各種部分甲基化單糖衍生物的歸屬，從而確定各單糖的連接位置，即糖苷鍵的位置。但甲基化分析還無法知道異頭碳糖苷鍵構型及多糖中單糖殘基的順序信息， 所要注意的是對含有糖醛酸或氨基己糖殘基的多糖比較難甲基化，而且有可能會產生二級產物，如糖醛酸殘基能產生縮酮衍生物，N—乙酰基氨基己糖殘基可產生N—甲基 -N-乙酰氨基己糖，對這些衍生物需要特殊分析技術才能鑒定。 ②過碘酸氧化及Smith降解 多糖的過碘酸氧化反應通常在pH3-5的水溶液中進行，用過碘酸鹽為氧化劑，因雙醛型的氧化產物在水中不穩定，因此需要在酸水解前用NaBH4將它們還原為醇，最后，通過水解產物的分析結果可獲得多糖中單糖連接的類型是l→4，1→-6，1→2，還是各種連接兼而有之。 Smith降解實際上是一種改良的過碘酸氧化，它是將多糖過碘酸鹽氧化，NaBH4還原后用弱酸部分水解 (通常在室溫下用稀無機酸水解還原產物)，生成具有特征性的糖連接的重復單元，從而獲得更多的結構信息。 ③部分酸水解這是多糖結構分析中一個很有用的技術，一是通過部分酸水解可以獲得結構較為容易測定的短鏈片段，從而集零為整推斷出多糖的結構。二是可以在特殊糖苷鍵處斷裂，幫助整個結構分析。如呋喃環結構的單糖對酸不穩定，用弱酸水解 (就可以得到這些殘基，再通過殘基片段的分析可得到有用的結構數據。一個成功的例子是枸杞子糖蛋白中一條由阿拉伯糖和半乳糖組成的O—連接多糖，并從甲基化分析結構得知，該多糖的非還原末端均為呋喃環阿拉伯糖，通過部分酸水解并用紙層析跟蹤檢測，首先釋放出Ara，到剛有Ga1釋放時終止水解，通過水解前后兩種多糖的甲基化分析結果比較，再結合其他方法測得的結果可推斷出整個多糖的可能結構。 ④乙酰解和甲醇解 乙酰解：多糖的乙酰解反應是在由乙酸酐、乙酸和硫酸組成的混合液中加熱進行的，在一定的糖苷鍵處裂解。研究表明，相同糖苷鍵在酸水解和乙酰解中的速度是不同的。乙酰解是酸水解的一種有用的補充，多糖可從這兩種不同的方法中獲得不同的片段，從不同的角度獲得多糖的結構信息。甲醇解：多糖在80-100℃條件下與無水甲醇氯化氫反應能將多糖變成組成單糖的甲基糖苷，這些甲基糖苷能轉化為三甲基硅醚衍生物或乙酰基衍生物，然后進行GC分析并與標準單糖對照，可得到組成多糖的各單糖的定量數據。（2）物理分析法 ①IR法：IR在多糖結構分析上主要是確定吡喃糖的苷鍵構型，以及常規觀察其他官能團。一般主要觀察730-960cm-1的范圍，如對于α-吡喃糖，δC1-H在 845 cm-1，而β-吡喃糖，δC1-H在890cm-1有最大吸收峰。 ②MS、GC-MS：GC分析多糖雖受樣品揮發性和熱穩定性的限制，但GC-MS是多糖結構分析不可缺少的工具，特別是對水解單糖、甲基化單糖及甲基化寡糖的分析，而且能鑒別出糖的異構體。MS在多糖結構分析中不僅在鑒別各種甲基衍生物的碎片，確定各種單糖殘基的連接位置時必不可少，而且由于FAB-MS、ESI-MS和 MALDI-MS等技術的出現，利用質譜還可以測定多糖的分子量及一級結構。 ③NMR：用NMR技術研究多糖結構的一個特點是不破壞樣品，對多糖的結構特征可通過化學位移、偶合常數、積分面積、NOE及馳豫時間等參數來表達。一維、二維圖譜 NMR在分析糖的構型、相互連接的位置及順序等方面具有廣闊的應用前景。 2、分子量及分子量分布多糖具有分子大小不均一的特點，近年來發現這些生物大分子的某一分子量范圍成分具有藥理活性，而另一分子量范圍的成分不具有藥理活性或具有一定的毒副作用，因此分子量及其分布既是這類藥物的有效性控制的指標又是安全性控制的指標，質量標準中制訂該項檢查十分必要，這也是近年來大分子聚合物藥物質量標準發展的一個明顯的特點。多糖分子量只是代表相似鏈長的平均配布，不同方法所測得的分子量不同，即使是同一多糖，其重均分子量與數均分子量也相差較大，通常采用凝膠色譜法控制這類藥物的分子量及其分布，應經研究選用與供試品分子大小相適應的色譜柱填充劑；使用的流動相通常為水或緩沖液，其pH值不應超過填充劑的耐受范圍，可加入適量的有機溶劑，但濃度不應超過30%，流速以 0.5-1.0ml/min為宜，因這類分子多無紫外吸收，一般采用示差折光檢測器，選用對照品的分子量范圍及顆粒形狀應與供試品匹配，測定數據經適宜的GPC軟件處理求得相關參數。 3、含量測定一般來講，多糖不含蛋白和氨基酸，蛋白或氨基酸檢測應呈陰性或符合限度檢查要求，如為糖蛋白或糖肽，應提供其證據，以保證產品不是多糖與蛋白的混合物；并提供其氨基酸構成及蛋白含量范圍，以保證質量穩定可控。對從天然植物中得到的多糖, 在結構研究中尤其對糖組成分析, 確定其中是否含有糖醛酸殘基具有很重要的意義。糖醛酸的含量測定目前較常用的是硫酸咔唑法，但容易受中性糖殘基的干擾。為了消除測定的干擾，可先測定樣品中中性糖的吸收度，然后從樣品的吸收度減去中性糖的吸收度，即為樣品中糖醛酸的吸收度值。間羥基聯苯法也是一種常用的多糖中糖醛酸含量測定方法,該法較硫酸咔唑法受中性糖殘基的干擾更小。多糖的含量測定可分為兩大類： 一類是直接測定多糖本身, 如高效液相色譜法和酶法；另一類是利用組成多糖的單糖縮合反應而建立的方法，如苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等。前者需要多糖的純品和特定的酶，后者測定時方法學干擾較大，現有的比色重現性差，受影響因素多。但由于目前國內的實驗條件，多糖的含量仍然主要采用這種方法，其原理為：多糖在濃硫酸水合產生的高溫下迅速水解，產生單糖，單糖在強酸條件下與苯酚反應生成橙色衍生物。在波長490nm左右處和一定濃度范圍內，該衍生物的吸收值與單糖濃度呈線性關系，從而可用比色法測定其含量，所用的單糖對照品盡量采用與其多糖組成一致或為含量較高的單糖，這樣測得的值較準確。需要強調的是，這種方法所測定的是總糖的含量而不是總多糖的含量，因此首先應測定樣品中游離的單糖含量，然后將總糖的含量減去游離單糖的含量，即為總多糖的含量。另外還可以采用3，5-二硝基水楊酸比色法（DNS法），它是在堿性條件下顯色，較準確測定還原糖與總糖的含量從而求出多糖的含量，可消除還原性雜質的干擾。