多聚酶鏈式反應即PCR（polymerase chain reaction）技術，應用這一技術可以將微量目的基因（DNA片段）擴增一百萬倍以上。
PCR反應理論的提出和技術的完善對于分子生物學的發展具有特殊的意義，它以敏感度高、特異性強、產率高、重復性好以及快速簡便等優點迅速成為分子生物學研究中應用最為廣泛的方法之一，并使得很多以往無法解決的分子生物學研究難題得以解決。發明這一技術的K. Mullis因此貢獻而獲得了1993年度諾貝爾化學獎。
一、PCR技術的工作原理
PCR的基本工作原理是以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板5'末端和3'末端互補的寡核苷酸片段為引物（primer），在耐熱DNA聚合酶的作用下，按照半保留復制的機制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA分子合成。重復這一過程，即可使目的DNA片段得以大量擴增。
組成PCR反應體系的基本成分包括：模板DNA、特異性引物、耐熱DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）、dNTP以及含Mg2＋的緩沖液。
PCR的基本反應步驟包括：
（1）變性：將反應體系加熱至 95℃，使模板DNA完全變性成為單鏈，同時引物自身以及引物之間存在的局部雙鏈也得以打開；
（2）退火：將溫度下降至適宜溫度使引物與模板DNA退火結合；
（3）延伸：將溫度升至72℃，耐熱DNA聚合酶發揮酶活性，以dNTP為底物催化DNA的合成反應。上述三個步驟構成一個循環，新合成的DNA分子繼續作為下一輪合成的模板，經多次循環（25～30次）后即可達到擴增DNA片段的目的。
二、PCR引物的設計
PCR反應成功的一個關鍵條件是正確設計引物。好的引物設計可以避免非特異產物的產生，也極大地影響著擴增產量。當然，有了好的引物，依然需要進行反應條件的優化。然而如果不遵守引物設計的基本規則，即使改變反應條件也不會有什么好效果。
引物設計需要在擴增特異性和擴增效率兩方面目標上取得平衡。目前，可利用計算機軟件方便地進行引物設計，引物設計軟件會通過每一引物設計變化的預定值在兩個目標間取得平衡，找出最佳引物。
不過，我們也須根據實驗具體要求進行適當調整（如在醫學診斷中，可以以犧牲效率為代價調整引物以提高特異性，因為在臨床診斷中避免假陽性比產生大量擴增產物更重要）。以下是引物設計的幾項基本原則。
1. 引物長度 在16～40 bp范圍內，以18～24 bp最佳。引物過短，會降低產物的特異性，每增加一個核苷酸，引物特異性可以提高4倍。注意，這里引物的長度是指與模板DNA序列互補的部分，并不包括為后續克隆而加的酶切位點等額外序列。引物過長，會使退火過程不完全，與模板結合不充分，以至引起擴增產物的明顯減少。
2. 引物末端 引物的3'末端對PCR反應是非常關鍵的。由于引物3'端的第一和第二個堿基影響Taq DNA聚合酶的延伸效率，因而會影響PCR反應的擴增效率及特異性。引物的最好選T、G、C而不選A；同時，引物的3'端應該為保守氨基酸序列，即采用簡并密碼少的氨基酸如Met、Trp，且要避免密碼子第三個堿基的擺動位置位于引物的3'端。
對于引物5'末端的堿基并無嚴格限制。當引物長度足夠時，引物5'端的堿基可不與模板DNA互補結合而呈游離狀態。因此可在引物5'端加限制性內切酶位點、啟動子或其他序列等，以便于PCR產物的分析、克隆。引物5'端最多可加到10個堿基而對PCR反應無影響。
一對引物之間可能存在互補序列，特別是3'末端應盡量避免互補，以免形成“引物二聚體”造成引物浪費和非特異擴增。每一個引物的內部也應盡量避免形成二級結構，特別是引物的末端應無回文結構。
3. 引物G＋C含量和Tm值 引物G＋C含量應該保持在40%～75%之間。G＋C含量50%的20個堿基寡核苷酸鏈的Tm值約在56℃～62℃范圍內。在此范圍內，既可以保證有效退火，又維持了良好的特異性。一般引物設計軟件在核苷酸序列確定后即可算出引物的Tm值、檢查有無引物二聚體以及回文結構等。
4. 引物的位置 引物的序列應位于基因組DNA中的保守區，且與非擴增區無同源序列，這樣可以減少引物與基因組的非特異結合，提高反應特異性。若是以cDNA為模板，則首先應盡力使引物和產物保持在mRNA的編碼區域內。其次，盡量把引物放到不同的外顯子上，以便使特異PCR產物與從污染DNA中產生的產物在大小上相區別。
三、PCR的基本操作步驟及條件優化
1. 基本操作步驟 PCR反應基本步驟是在反應管中加入PCR反應緩沖液、dNTP、引物、DNA模板和耐熱DNA聚合酶，混勻后加石蠟油封蓋防止反應液的揮發（目前有些PCR儀在無特殊要求時可不用石蠟油封），然后將反應管置于PCR儀中開始以下循環反應：
①變性（Denature）：模板DNA在95℃左右的高溫條件下氫鍵斷裂，雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA并游離于反應液中。
②退火（Annealing）：人工合成的兩條寡核苷酸引物在適當溫度下分別與模板DNA擴增區域的兩端按堿基互補配對結合，此時，DNA聚合酶便可開始合成新鏈。由于添加的引物分子數遠大于模板DNA的分子數，因此引物與模板DNA形成復合物的幾率遠遠高于DNA分子自身的復性。
③延伸（Extension）：在4種dNTP底物及Mg2+存在的條件下，耐熱DNA聚合酶在最適溫度下將單核苷酸按堿基互補配對原則從引物的3'端摻入，使引物沿5'→3'方向延伸合成新股DNA。每一循環的產物再作為下一循環的模板。
整個PCR反應一般須進行30輪的循環。在最初的循環階段，原來的DNA鏈起著模板的作用，隨著循環次數增加，新合成的引物延伸鏈急劇增多而成為主要模板，因此PCR擴增產物將受到所加引物5'末端的限制，使終產物序列介于兩種引物5'末端之間的區域。
2. 條件優化 PCR方法操作簡便，但影響因素頗多，因此需要根據不同的目的及不同的DNA模板，探索最適條件，以獲得最佳反應結果。以下主要從反應的特異性、敏感性、忠實性及擴增效率等四個方面討論PCR反應條件的優化。
（1）PCR反應循環參數：
①變性：變性溫度過高或變性時間過長都會導致耐熱DNA聚合酶活性的喪失，從而影響PCR產物的產量。但變性溫度過低或變性時間過短則會導致DNA模板變性不完全，使引物無法與模板結合，同樣會導致PCR反應的失敗。通常情況下，95℃變性20～30 s即可使各種DNA分子完全變性。
②退火：引物與模板的退火溫度由引物的長度及G＋C含量決定。退火溫度一般應比Tm值低3℃～12℃（5℃為宜，但不應超出15℃）。增加退火溫度可減少引物與模板的非特異結合，提高PCR反應的特異性；降低退火溫度則可增加PCR反應的敏感性。退火時間一般為20～40 s，時間過短會導致延伸失敗；時間過長則易產生引物二聚體或導致非特異性配對。
③延伸：延伸溫度取決于所用耐熱DNA聚合酶的最適溫度，通常為70℃～75℃，一般不隨意更改。延伸時間取決于擴增片段的長度：目的片段小于500 bp時，延伸時間為20 s；目的片段在500～1200 bp時，延伸時間需40 s；目的片段大于1200 bp則還需增加延伸時間。另外，還可以500 bp/30 s為基準，根據目的片段長度計算反應時間。目的片段小于150 bp時甚至可以省略延伸步驟，因為退火溫度下DNA聚合酶的活性已足以完成短序列合成。
④循環次數：主要取決于模板DNA濃度，一般為25～35次，此時PCR產物的積累即可達到最大值。在得到足夠產物的前提下應盡量減少循環次數。
（2）反應增強劑：PCR反應中加入一定濃度的增強劑如1%～10%二甲基亞砜（DMSO）、5%～20%甘油、非離子去污劑、1.25%～10%甲酰胺和10～100 μg/ml牛血清白蛋白等可提高反應特異性和產量，有些反應只能在這些輔助劑存在時才能進行。
（3）熱啟動PCR：如果PCR反應混合物置于低于Tm值溫度時，會在極短時間內產生引物二聚體和非特異性配對，而熱啟動PCR方法則可大大減少這種情況的發生。具體方法是：先將PCR反應體系升溫至95℃，預變性2～5 min后，將儀器設在暫停，在這一高溫條件下迅速加入耐熱DNA聚合酶后再恢復循環。熱啟動可以防止模板變性不充分，同時還避免了耐熱DNA聚合酶活性的迅速下降。
四、PCR技術的主要用途
1. 目的基因的克隆 PCR技術為在重組DNA過程中獲得的目的基因片段提供了簡便快速的擴增方法。該技術可用于：
①與逆轉錄反應相結合，可以直接從組織和細胞的mRNA獲得目的基因片段；
②利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因片段；
③利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中提取具有一定序列相似性的基因片段；
④利用隨機引物從cDNA文庫或基因組文庫中克隆基因。
2. 基因的體外突變 利用PCR技術可以隨意設計引物在體外對目的基因片段進行嵌和、缺失、點突變等改造。
3. DNA和RNA微量分析 PCR技術高度敏感，對模板DNA的含量要求很低，是DNA和RNA（RNA一般需要先逆轉錄成為cDNA）微量分析的好方法。從理論上講，只要存在1分子模板，就可以獲得目的片段。在實際工作中，一滴血、一根毛發或一個細胞就足以滿足PCR的檢測需要。因此，PCR在基因診斷方面具有極廣闊的應用價值。
4. DNA序列測定 將PCR技術引入DNA序列測定，可使測序工作大為簡化，也提高了測序的速度。待測DNA片段既可以克隆到特定的載體后進行序列測定，也可直接測定。
5. 基因突變分析 基因突變可引起許多遺傳病、免疫性疾病和腫瘤等，故分析基因突變可以為這些疾病的診斷、治療和研究提供重要的依據。利用PCR與一些技術的結合可以大大提高基因突變檢測的敏感性。
五、幾種重要的衍生PCR技術
PCR技術的發展以及和已有分子生物學技術的結合形成了多種PCR衍生技術，大大提高了PCR反應的特異性和應用的廣泛性。現僅舉幾例介紹與醫學研究密切相關的PCR衍生技術。
1. 逆轉錄PCR技術
逆轉錄PCR（reverse transcription PCR, RT-PCR）是將RNA的逆轉錄反應和PCR反應聯合應用的一種技術。即首先以RNA為模板，在逆轉錄酶的作用下合成cDNA，然后再以cDNA為模板通過PCR反應來擴增目的基因。RT-PCR是目前從各種組織或細胞中獲得目的基因以及對已知序列的RNA進行定性和/或定量分析的最有效方法之一，具有敏感度高、特異性強和省時等優點。
2. 原位PCR技術
原位PCR（in situ PCR, ISP）是在福爾馬林固定、石蠟包埋的組織切片或細胞涂片上的單個細胞內進行的PCR反應，然后用特異性探針進行原位雜交，即可檢出待測DNA或RNA是否在該組織或細胞中存在。原位PCR方法彌補了PCR技術和原位雜交技術的不足，是將目的基因的擴增與定位相結合的一種好方法。
3. 實時PCR技術
實時PCR（real time PCR）技術是近年發展起來的一種新的核酸微量分析技術，尤其是在定量RT-PCR中具有重要的價值。
實時PCR的基本原理是引入了熒光標記分子，使在PCR反應中產生的熒光信號與PCR產物的量成正比，對每一反應時刻的熒光信號進行實時分析，便可計算出PCR產物的量。根據動態變化數據，可以精確計算出樣品中原有模板的含量。
與傳統PCR反應相比，在常規的正向和反向PCR引物之間增加了一對特殊的引物作為探針，探針的5'端有一個熒光報告分子（reporter, R），3'端有一個熒光淬滅分子（quencher, Q）。
沒有擴增反應時，探針保持完整，熒光報告分子和熒光淬滅分子同時存在于探針上，于是熒光信號被淬滅，無熒光信號釋放。隨著PCR的進行，Taq DNA聚合酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合著的熒光探針，其5′→3′外切核酸酶活性就會將該探針逐步切斷，報告熒光基團一旦與淬滅基團分離，便產生熒光信號。后者被熒光監測系統接收，用于數據分析。實時PCR技術實現了PCR反應從定性到定量的飛躍，目前已逐步得到廣泛的應用。