（2）雜交后洗脫、抗體檢測和復染
1.準備封閉液和抗體溶液1?3。
2.振蕩抗體溶液，在微型離心機中以最大轉速離心10min。避光放置，如有必要可在室溫中預溫。
3.加洗脫液I到干凈的染色缸中，水浴中預溫到72℃后調整pH至7.0。
4．加洗脫液II到干凈的染色缸中，室溫（20?25℃)放置。
5.同時將用水濕潤的吸水紙放在一個空的避光塑料玻片盒（如空的玻片盒）的底部。
6.用剪刀為每個標本準備4張大小約為22mm×64mm的封口膜。
7.從避光塑料盒中取出標本，在紙上快速去掉蓋玻片。
8.立即將片子放在洗脫液I中2min，用鑷子夾住片子，輕輕的上下振蕩。
9.轉移到洗脫液n中30s。
10.夾住片子的長邊，在紙上瀝去過量液體10?20s，注意不要使片子表面過于干燥。
11.將片子架到預先準備好的避光塑料玻片盒子中（如玻片兩端搭在玻璃棒上或盒子底部平臺上），取300μL封閉液加到片子上，用封口膜覆蓋，避免產生氣泡。
12.蓋上玻片盒蓋子，37℃溫箱中孵育40?50min。
13.37℃預熱1.5LST緩沖液。?
14.孵育完成后去掉封口膜，將片子放在標本架上浸泡在預熱的ST緩沖液中。
15.放在搖床平臺上振蕩3min，將倒置的避光容器放在上面保持暗環境。
16.按步驟10所示方法瀝去標本上的過量液體。
17.將片子放到避光塑料玻片盒中架子上，取80μL抗體溶液1加到雜交區域。
18.用封口膜覆蓋，避免產生氣泡
19.蓋上蓋子，37℃溫箱中孵育10min。
20.去掉封口膜，將片子放在標本架上浸泡在預熱的ST緩沖液。
21.放在搖床平臺上避光振蕩3min。?
22.倒掉原來的ST緩沖液，更換新的預熱ST緩沖液。
23.重復2次步驟21和22。
24.洗完3次后，按步驟10所示方法瀝去過量液體。
25.將片子放到塑料避光容器中架子上，取5OμL抗體溶液2加到雜交區域。
26.用封口膜覆蓋，避免產生氣泡。
27.蓋上蓋子，37℃溫箱中孵育10min。
28.去掉封口膜，在熱的新ST緩沖液中洗3次，每次3min。
29.將片子按步驟10所示瀝去過量液體。
30.將片子放到塑料避光容器中架子上，取80μL抗體溶液3加到雜交區域。
31.蓋上蓋子，37℃溫箱中孵育10min。
32.去掉封口膜，在熱的新ST緩沖液洗3次，每次3min。
33.在最后ST緩沖液洗脫過程中，加大約25μLDAPI復染液到放在紙上的22mm×22mm蓋玻片上。
34.將片子按步驟10所示瀝去過量液體。
35.輕輕地將片子的雜交區域倒扣到加有DAPI復染液的蓋玻片上。
36.將吸水紙蓋在標本上方，輕輕按壓以除去過量的復染液。
37.檢查復染的區域，用鈍頭鑷子輕輕按壓排掉氣泡。
38.將指甲油涂在蓋玻片周圍來封片。
39.按二、（5）中所示方法避光放置至干燥后用熒光顯微鏡觀察。
收起
注意事項
1.要制備高質量的染色體標本，最好使用肝素鋰抗凝管收集外周血樣品，樣品應該室溫運輸并盡塊進行培養。固定的細胞懸液質量隨著儲存時間的增加會明顯下降。
2.封閉液可以大量制備，過濾后分裝，可在4℃儲存至6個月。
3.1mL抗體溶液4℃避光可儲存1個月。
4.為避免污染，細胞培養基應使用細胞培養專用的水浴鍋。
5.秋水仙胺阻止紡錘體形成，使細胞染色體阻滯在細胞分裂中期。秋水仙胺處理細胞的時間影響染色體的形態。如果處理時間太短，染色體可能會比較長，造成分裂指數較低；如果處理時間過長，染色體會太短而不適于分析。
6.低滲處理時間不夠時，染色體無法從細胞中釋放。處理時間過長，會造成大量細胞提前破裂。
7.盡管ChromoprobeMultiprobe?-T試劑盒提供的探針和試劑已經由Cytocell公司質檢過，還是建議先使用高質量的正常對照染色體懸液進行預實驗優化試劑盒雜交條件，然后再進行非常重要的待測樣品的雜交。
8.盡管理想的分裂指數應>5%，但是有時會存在一些問題無法達到這個指標，例如，樣品的制備時間長短或者來源（如白血病樣品的有絲分裂就常常不夠)。在這種情況下，應該確保在標本中央區約有5個中期分裂相。當有些樣品的分裂指數非常低且樣品又少的情況下，應該選擇使用多色FISH技術，如MTEL來分析樣品。
9.如果僅僅是少數方形塊上的中期染色體不夠，可以在原來上樣的位置再點樣。
10.可以將標本加熱塊翻轉使得最上面是平面作為37℃加熱板。但75℃電熱恒溫板必須是實心的，表面溫度均勻。
11.最好是用一只手的食指和拇指拿住磨砂位置舉起片子/Multiprobe裝置，然后用另一只手的食指和拇指拿住（勿擠壓裝置）片子/Multiprobe裝置，并翻轉，可以用手掌或者用托盤托住保持水平進行轉移。
12.正確的變性是很重要的。如果染色體變性時間太長，染色體會發脹并有可能沿著染色體臂留下探針信號（圖2C)。相反，變性時間不夠，雖然能保持染色體形態，但是如果能雜交上則雜交效率很低。總之，-20℃儲存越久的細胞懸液，染色體變性時間應越長。例如，標本制備與雜交在同一天，那么變性的時間僅需要45s，然而一個樣品放置超過一年，變性時間大于3min。制備時間為1?3月的樣品75℃平均變性時間是1min、15s。
13.—些顯微鏡的載物臺使觀察片子末端比較困難，如果遇到這種情況，可以采用180°旋轉片子的方式使末端容易觀測。
14.在記錄結果以前，應該先熟悉使用的端粒克隆特點以避免發生錯誤的解釋。某些克隆用于多態性檢測是很正常的，這些克隆只和對應的同源端粒雜交，但是如果存在多態性，這些克隆僅有部分雜交上或者根本就沒和同源的染色體雜交上。另外，有些克隆有交叉雜交的特點，這些克隆除了與同源的端粒雜交外，還和其他端粒雜交。舉例說明，如圖2中顯示正常的3p3q雜交模式、2q探針多態性、12p的交叉雜交以及的一種具臨床意義的不平衡端粒重排。表2列出了已知的第一代和第二代端粒克隆的多態性和交叉雜交模式。
15.當必須重復實驗時，應該確定使用整個新的Multiprobe?玻片和裝置是否合理。其他可選擇的方式包括：①重新購買已經標記好的單個端粒探針（Cytocell公司或AppligeneOncor或Vysis);②獲得一套甘油保存的端粒克隆，自己制備DNA和雜交用探針。后一種方式是比較經濟的，一旦擴增克隆就可以批量標記和儲存探針，合適的探針可以在-20℃至少儲存2年。表1列出第一代和第二代端粒克隆有哪些，這些克隆的甘油保存株或穿刺培養物可以從何處獲得;同時標記出ChromoprobeMultiprobe?-T試劑盒使用的端粒克隆。
16．—些與眾不同的的結果可能反映真的亞端粒重排或者端粒多態性，但是此時更應該避免錯誤解釋的發生。表2列舉了使用第一代和第二代端粒特異性克隆探針有關的多態性和交叉雜交模式。圖2是FISH實驗實例
17.如果使用Cytocell公司ChromoprobeMultiprobe?-T試劑盒或其他市售試劑盒（如Vysis公司的TotelVys10nMulticolorFISHProbePanel試劑盒）就沒必要制備端粒克隆DNA。但是可以獲得和保存一套端粒克隆，以備少量重復實驗所需。表1列出第一代和第二代端粒克隆有哪些，這些克隆的甘油保存株或穿刺培養物可以從何處獲得，表1中的清單也包括ChromoprobeMultiprobe?-T試劑盒使用的端粒克隆。
18.如果沒有干冰，甘油保存株可以放在冰上較短的時間，但是反復這樣操作會降低甘油保存株的活性。
19.如果沉淀沒能很快懸起，可以在4℃條件下放置過夜。
20.如果使用Cytocell公司ChromoprobeMultiprobe?-T系列試劑盒或其他市售試劑盒，不需進行此部分的操作
21.因為間接標記的探針可以保存2年左右，所以可以增加標記的DNA量和標記反應體積。，
22.批號不同的DNA酶可能其實際濃度也有差異，不同的模板使用的DNase用量也不同。最好在使用每一批新DNA酶時，對模板所用的酶量和反應時間進行優化，以備將來應用相同的條件標記同種模板探針。
23.每一批次探針的制備都應該優化Cot-1的使用量。Cot-1的用量應根據探針中Alu序列的含量。對端粒克隆而言，插入片段為30?40kb的標記黏粒，Cot-1的用量一般是625ng/juL探針混合物；插入片段為小于100kb左右的PAC和小的BAC探針，Cot-1的用量一般是1嘩/斗探針混合物；大的BAC探針，可加到3μL探針混合物。注意例外的是19號染色體的探針克隆，如F20643和20283需要加入10μL探針混合物。
24.如果沒有電熱恒溫板，染色體可以在10%甲酰胺/0.1mol/L EDTA/2×SSC中70℃變性5min后，在4℃下用2×SSC洗3次，然后用系列乙醇脫水。探針混合物在加入到標本上之前進行單獨變性，95℃、5min。
25.應該根據單色或雙色檢測的需要正確配制抗體溶液，抗體濃度是非常重要的。如果抗體的濃度太低，就可能沒有雜交信號或雜交效率很低。相反，濃度太髙，可能會出現斑點樣的背景，無法分辨是同源信號還是背景（圖2D)。由于不同批次的抗體可能存在差異，所以在測試正式樣品前，最好是先用可靠的對照探針與高質量的染色體懸液進行雜交，優化抗體稀釋的濃度