多重PCR擴增實驗

多重PCR（multiplex PCR），其反應原理，反應試劑和操作過程與一般PCR相同。一般PCR僅應用一對引物，通過PCR擴增產生一個核酸片段，主要用于單一致病因子等的鑒定。

重PCR的特點有：

①高效性

在同一PCR反應管內同時檢出多種病原微生物，或對有多個型別的目的基因進行分型，特別是用一滴血就可檢測多種病原體。

②系統性

多重PCR很適宜于成組病原體的檢測，如肝炎病毒，腸道致病性細菌，性病，無芽胞厭氧菌，戰傷感染細菌及細菌戰劑的同時偵檢。

③經濟簡便性

多種病原體在同一反應管內同時檢出，將大大的節省時間，節省試劑，節約經費開支，為臨床提供更多更準確的診斷信息

DNA樣本

Taq 聚合酶 溶于水的 DNA 引物

熱循環儀

一、材料

1. 酶和酶緩沖液

Taq 聚合酶
許多 Taq 聚合酶都可以用；作者發現 Roche 公司的 Taq 聚合酶可以滿足大多數需要. 如果需要提高PCR 產物的特異性，應該使用熱啟動聚合酶。使用 Tag 聚合酶本身附帶的緩沖液。

2. 核酸和寡核苷酸

（1）溶于水的 DNA

如果 DNA 在 TE 中，應該在 PCR 反應混合物中添加 MgCl₂。如果用從石蠟包埋的組織中純化的DNA 做模板，選擇的 STR 標記的大小應該是 78~250bp, 因為這些 DNA 模板的完整性不定。
參照 DNA 可以從外周血組織或者非惡性組織中純化獲得。對于白血病，則難以獲得腫瘤 DNA 的合適的參照 DNA。因此，使用從患病期間和痊愈之后的血液中提取的 DNA 作參照進行分析。
腫瘤 DNA。很難避免非惡性細胞對腫瘤組織的污染。對腫瘤組織進行顯微解剖是避免污染的一種途徑，但是該過程費時，而且產量低。
為了保證獲得 LOH 分析的信患，應該分析大量的樣品。因此，純化過程必須是可靠的，可重復的，保證可以從大量的樣品中提取出高質量的 DNA。一種評估腫瘤 DNA 質董的方法就是利用一部分樣品，使用 STR 對已經確定的特異類型的腫瘤染色體上的 LOH 進行分析。

（2）引物

重要的一點就是細心地選擇熒光基團以確保在所用的電泳儀器上能被檢測到。例如，綠色的 TET 就不能在 ABI3100 儀器上使用。
標記的引物儲備液可以保存在-20 ℃, 稀釋之后的工作液可以在 4℃ 保存。放置黑盒中避光。

3. 專用設備

熱循環儀

二、方法

1.在 0.2 ml 的離心管中，加入以下試劑。
 
DNA(溶于水）                              10~20ng

引物（每一種）*                           1pmol/L**

dNTP 溶液                                      250umol/L

Taq 聚合酶緩沖液                           1X

Taq 聚合酶（Roche)                       0.18U

H₂0 加到                                          6ul***

*每一標記組的毎一種引物分別被一種熒光基團標記.

**1.5~2.0pmol 的引物適合于許多反應。

***10ul 的終體積用于帶有熱蓋的 PCR 儀上（樣品上層不加礦物油）。


2.使用下面通用的 PCR 擴增程序進行 PCR 操作。

3.在瓊脂糖凝膠上分析 3ul 的 PCR 產物。如果使用了新的引物，應用瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR 產物。在毛細管電泳之前，從 96 個樣品中隨機選擇幾個 PCR 產物進行分析。

4.如果在不同的退火溫度下都沒有得到 PCR 產物，那么在數據庫中査看標記內部的CG 含置和特異的 CpG 島。大董的 STR，特別是三核苷酸的 STR, 僅由 C 和 G 組成。當PCR 富含 GC 片段時，如第 5 章所述加入甜菜堿和 DMSO。

在多重PCR中，所有引物Ta值應相近。如果兩對引物Tq值差異超過±℃10%，會使擴增產物的量明顯不同，其中一種擴增產物或目的DNA很難觀察到。另外，靶DNA的長度也應相近，差別大時短片的靶DNA會優先擴增，因此，會產生不同產量的擴增產物，為此，須采用DNA搖擺擴增或加入不等量的引物方法進行解決。

多重PCR的主要用于多種病原微生物的同時檢測或鑒定某些病原微生物、某些遺傳病及癌基因的分型鑒定。

本實驗來源于 PCR 實驗指南（第二版），作者：種康，瞿禮嘉。