由于在一個多重PCR反應體系中有多對引物,而且擴增的模板片段長度也不盡相同,所以各對引物的擴增效率和擴增速度也不相同。
由于多重PCR反應總是遵循較小片段優先擴增的原則,各對引物所要求最佳PCR條件也不盡相同(設計多對引物進行多重PCR時,應使各引物所需PCR擴增條件盡可能一致),因此在選擇多重PCR擴增條件(尤其是退火溫度和時間)時應盡量選擇有利于較大片段擴增的條件
(1)退火時間和溫度在循環參數中,影響多重PCR擴增效率的主要因素是復性溫度和延伸時間。復性溫度的設置策略與單個PCR相似。先計算引物的熔解溫度(Tm),在此基礎上推算復性溫度T。(T=T。-5)。然后用“逐步引人法”確定多重PCR的最佳T,即每增加一對引物,就根據擴增的結果調整復性溫度,直至每一種被擴增的基因片段都獲得滿意的效果。延伸時間是影響擴增產量的重要因素。隨著擴增的基因座數目的增加,延伸時間也應延長。在最佳的Mg2+和dNTP濃度范圍內通過延長延伸時間來提高擴增產量,比單純增加Mg2+和dNTP濃度更為有效。 退火時間對擴增效率的影響遠遠小于退火溫度的影響,將退火溫度降低4~6℃對于在多重PCR中擴增出同樣的基因是必需的。多重反應中并發的其它基因的特異擴增會消除非特異擴增的影響,同樣,擴增效率高的基因會使擴增效率低的基因的擴增產量降低 。
(2)延伸溫度高的延伸溫度會減少某些基因的擴增,即使用長的退火時間和延伸時間也可能無法消除這種影響。
(3)延伸時間在多重PCR中,由于同時擴增多個基因,酶和dNTP的缺乏就成為限制因素,就需要更多的時間來完成所有產物的合成。多重PCR中增加延伸時間,可以增加較長PCR產物的量。也有實驗表明,當延伸時間延長時,所有基因的PCR產物量都增加了 4)PCR循環數PCR產物量增加最明顯的是在25個循環附近。通常對于一個反應,2830個循環就足夠了,增加至60個循環對產物量無明顯影響 總之,多重PCR反應條件的設置是一個棘手的問題,也是多重PCR成功的保證。一般策略是首先進行單個PCR反應,分別設定各引物對應的條件;然后,依次增加引物對,不斷調整反應條件直至最后保證所有的引物對都能在同一條件下擴增出目的條帶。