大腸桿菌感受態細胞的制備及轉化實驗原理和步驟

[實驗原理] （供參考，試劑盒的Solution SS成分未知）
細菌處于容易吸收外源DNA的狀態叫感受態。轉化是指質粒DNA或以它為載體構建的重組子導入細菌的過程。其原理是：在0℃下的CaCl2低滲溶液中，細菌細胞膨脹成球形。轉化緩沖液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羥基—鈣磷酸復合物，此復合物粘附于細菌細胞表面。42℃短時間熱處理（熱休克），可以促進細胞吸收DNA復合物。將處理后的細菌放置在非選擇性培養液中保溫一段時間，促使在轉化過程中獲得的新的表型(如Amp抗性) 得到表達。然后再涂布于含有氨芐青霉素的選擇性平板上，37℃培養過夜，這樣即可得到轉化菌落。

[儀器、材料與試劑]
(一)儀器
1．小型高速離心機
2．恒溫搖床
3．恒溫箱
4．-20℃冰箱
5．恒溫水浴器

(二)材料
1．氨芐青霉素
2．大腸桿菌DH5a
3．pUC19
4．1.5mL 離心管
5．槍頭、槍
6．試管、培養皿
(三)試劑
1．快速感受態細菌制備試劑盒（申能博彩公司產品）
2．LB培養液
在950mL去離子水中加入：
胰蛋白胨 (tryptone) 10g
酵母提取物 (yeast extract) 5g
NaCl 10g
搖動容器直至溶質完全溶解，用Na0H調節pH至7.0，加入去離子水至總體積為1L，121℃濕熱滅菌20min。
3．氨芐青霉素(Amp)，用無菌水配制成100mg／mL 溶液，置-20℃冰箱保存。

[實驗步驟]
1．從大腸桿菌DH5a平板上挑取一個單菌落接于2mL LB培養液的試管中，37℃振蕩培養過夜。
2．取50mL菌液轉接到一個含有5mL LB培養液錐形瓶中，37℃振蕩培養2小時。
以下步驟按修改后的試劑盒說明書進行。
3．用滅菌的槍頭取0.5mL的大腸桿菌培養物于1.5mL滅菌離心管中，冰上放置3分鐘后，加入0.5mL預冷的Solution SS。在冰上小心地用1mL 槍頭將細胞懸浮起來。注意：1mL的取液器設定在500mL。懸浮細胞要輕，防止細胞進入槍內。
4．將上述細胞分裝于1.5mL離心管 (離心管要在放在冰上預冷) 中，每管0.1mL。細胞可以立即使用或儲存。
5．將感受態細胞迅速轉移到-20℃或更低的低溫冰中。注意：在轉移過程中要防止溫度升高，解決的辦法之一是在塑料袋里裝上低溫冰塊，將細胞迅速轉移到塑料里，將整個塑料袋放到低溫冰箱內。

轉化：
1．新鮮制備的或-20℃下保存的100mL感受態細胞，置于冰上，完全解冰后輕輕地將細胞均勻懸浮。
2．加入5mL pUC19質粒，DNA濃度為10pg/mL，輕輕混勻。
3．冰上放置30分鐘。
4．42℃水浴熱激60秒。
5．冰上放置2分鐘。
6．加400mL LB培養液，37℃ 250轉／分振蕩培養30分鐘。
7．室溫下4000rpm離心5分鐘，用槍頭吸掉400mL 上清液，用剩余的培養液將細胞懸浮。
8．將細菌涂布在 Amp/LB瓊脂平板上。
9．平皿在37℃下正向放置1小時，待接種的液體吸收進瓊脂后，將平皿倒置，培養過夜。

[實驗結果]
經37℃培養過夜的、在氨芐青霉素/LB瓊脂平板上出現的菌落即為pUC19質粒轉化的大腸桿菌。計數菌落總數，計算制備的感受態菌的轉化效率，以每mg 質粒DNA 轉化的菌落數表示。