大腸桿菌雜交及基因定位

一、原理

大腸桿菌染色體呈環狀。高頻重組菌株（Hfr）的染色體上整合有F因子，當Hfr細菌與F－細菌細胞發生接合（即雜交）時Hfr細胞（供體菌）的染色體從Hfr細胞向F－細胞內轉移。由于染色體的轉移具有一定的方向性，并且可以隨時中斷，因此根據結合后F－細菌（以重組子形式選出）中Hfr細菌染色體基因出現次數的多少，即可得知基因轉移的先后順序，也就是說基因在染色體上排列的順序。轉移時，靠近轉移起始點的染色體基因進入F－細胞的機率大，重組頻率高，遠離轉移起始點的基因進入F－細胞的機會少，重組率低，F因子大部分位于轉移起始點相對的一端（末端）。因此轉移的頻率很低。只有當接合時間很長，足以使整個染色體轉入F－細胞（受體）時，才會使F－細胞轉變為Hfr或F＋狀態。

基因定位時首先要從Hfr與F－細菌的混合培養物中篩選出某一Hfr與F－細菌基因（選擇性標記基因）已經發生了重組的細菌（重組子），然后在這些重組子中逐個測定其它的Hfr基因（非選擇標記）出現的次數。Hfr菌株染色體上的選擇性標記應位于染色體前端，這樣才能保證以100％的頻率出現在重組子中。選擇性標記之后的基因，則以低于100％的頻率出現在重組子中。F－細胞的選擇性標記應起到排除Hfr菌生長的作用（即反選擇）。本實驗使用的F－菌株為Strr, Hfr菌為Strs,借此可排除Hfr菌的生長。另一方面為保證Hfr基因有機會出現在重組子中，反選擇性標記應位于染色體后端。為了使Hfr菌株有較高的接合頻率，F－細菌應該過量以保證每一個Hfr細菌都能與F－細菌接合（10～20：1）。

二、目的

通過本實驗，了解大腸桿菌雜交及其基因在染色體上的排列方式，并掌握大腸桿菌接合及染色體基因定位的原理與方法。

三、材料、試劑與器具

1、受體菌：FD1004　F－leu purE trp his metA ilv arg thi ara lacY xyl mtl galT strr rifr。

2、供體菌：CSH60 Hfr sup strs。

3、生理鹽水：0.85%NaCl。

4、10×A緩中液。

5、基本培養基。

6、LB培養基。

7、選擇培養基[B]—[G]：基本培養基加氨基酸（表1－2）。

8、培養皿、三角瓶、吸管、滅菌牙簽、搖床、酒精燈、接種環。
四、操作步驟

1、第一天傍晚，分別接一環供體菌和受體菌于5ml LB培養液中，37℃振蕩培養10－12小時。

2、第二天清晨，各取1ml過夜培養物，分別加入到2個盛有5ml LB培養液的250ml三角瓶，37℃振蕩培養2－3小時。

3、吸取0.5ml供體菌和4.5ml受體菌，加入到一個無菌的250ml三角瓶中混合，置37℃搖床上培養100分鐘。

4、將上述接合菌液用生理鹽水稀釋10⁰、10^-1、10^-2倍。

5、各吸取0.1ml稀釋液涂布在選擇培養基[A]平板上，每一種稀釋液涂布2個平板。同時將供體菌及受體菌分別吸取0.1ml涂布在[A]上作對照，每種各2個平板。此后均于37℃條件下培養48小時。

6、第四天，1）觀察和計數選擇培養基[A]平板上接合組和對照組的菌落生長狀況；2）在與平皿相同大小的白紙上畫100個小格，將圓片貼于選擇培養基[B]、[C]、[D]、[E]、[F]和[G]平板的底部，然后用滅菌牙簽從接合組選擇培養基[A]平板上隨機挑選100個菌落，對號點種在選擇培養基[B]、[C]、[D]、[E]、[F]和[G]平板的100個小格中；3）將所有平板置于37℃箱內培養48小時。

7、第六天，統計在各種選擇平板上生長菌落的數目，記錄于表1－1中。并繪制出基因順序圖。

表1－1　各選擇培養基上生長的菌落數目統計

表1－2　選擇性培養基附加成份表