大腸桿菌電轉化感受態細胞制備流程及轉化方法

實驗概要

大腸桿菌電轉化感受態細胞制備流程及轉化方法

實驗步驟

第一天：

1. 將適合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他營養豐富的培養基上，在37°C下過夜培養

2. 高溫滅菌大的離心瓶(250-500ml)以備第二天搖瓶用

3. 準備幾瓶滅菌水(總量約1.5升)，保存于冷凍室中以備第二天重懸浮細胞用

第二天：

4. 轉移0.2-1ml過夜培養物至裝有500ml LB(或其他營養豐富的培養基)的1-2升搖瓶

5. 37°C下劇烈振蕩培養2-6小時

6. 定時監控OD600值(培養1小時后每半小時測定一次)

7. 當OD600值達到0.5-1.0時，從搖床中取出搖瓶，置于冰上冷卻至少15分鐘(需要的話這種方式可以存放培養液數小時)

8. 細胞在4°C 5000g下離心15分鐘，棄上清液(如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一兩天)

9. 用滅菌的冰水重懸浮細胞。先用渦旋儀或吸液管重懸浮細胞于少量體積中(幾毫升)，然后加水稀釋至離心管的2/3體積。

10. 照上面步驟重復離心，小心棄去上清液

11. 照上面步驟用滅菌的冰水重懸浮細胞

12. 離心，棄上清液

13. 用20ml滅菌的、冰冷后的10%甘油重懸浮細胞

14. 照上面步驟離心，小心棄去上清液(沉淀可能會很松散)

15. 用10%甘油重懸浮細胞至最終體積為2-3ml

16. 將細胞按150μl等份裝入微量離心管，于-80°C保存

轉化方法：

1. 在冰上解凍電感受態細胞添加1-10μl DNA，冰上培育約5分鐘

2. 添加1-3μl DNA，冰上培育約5分鐘

3. 轉移DNA/細胞混合物至冷卻后的2mm電穿孔容器(無泡)中

4. 加載P1000，準備好300μl LB 或 2xYT

5. 對電穿孔容器進行脈沖(200 歐姆， 25μFd，2.5 千伏)(檢查時間常數，應該在3以上)

6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至電穿孔容器中

7. 37°C下培養細胞40分鐘至1小時以復原

8. 轉移細胞至適當的選擇培養基上培養