大腸桿菌破碎壓力

　　細菌的破碎在生物行業的應用是細菌培養完成、離心后的一個重要工藝，這其間所涉及的幾個主要技術要點分別是：細菌的重懸，細菌破碎率，溫度控制。

　　第一， 細菌重懸

　　細菌的重懸對于每一個做過細菌破碎的用戶來說都是非常熟悉的一件事情，培養好的細菌經離心收集之后在破碎之前必須將收集好的菌泥與緩沖液按照一定的配比進行重懸，重懸好之后才能進行破碎。由于高壓細胞破碎機對于待處理樣品的均一性要求比較高，所以細菌在重懸過程中濃度可以高也可以低，但是菌體在緩沖液中必須懸浮得非常均勻。

　　傳統用于細菌重懸的方法通常是玻璃棒攪拌，磁力攪拌或者振動的方式，對于小量樣品來說重懸的效果一般都沒有問題，但是如果樣品量較多時，此類方法耗時非常長，而且重懸的效果不好，而這一工藝很多用戶往往由于習慣成自然而沒有考慮是否有更好的方法？

　　筆者在第一講”均質機的大名小名”中介紹過了一種高速剪切分散機，這個設備對于做藥劑、食品、化工的用戶來說是非常熟悉的一個產品，是所有制備樣品所必須的一個設備。其實，這個設備也是一個非常好的細菌重懸的設備！如果樣品量在500ml以上，直至噸級的樣品，這個設備都有配套的型號提供。如500ml的樣品用此設備進行重懸處理時一般只需要1~2min即可達到非常好的重懸效果，經此設備處理后的樣品進入高壓細胞破碎機進行處理時不會對設備造成任何的損壞，是一個非常好的配套前處理設備。

　　第二， 細胞破碎率

　　為了盡量多的提取細菌里面的目的蛋白，用戶們都希望高壓細胞破碎機對于細菌的破碎率能達到一個非常好的效果。當然，如果能到100%當然就更好了！如何去測定經細胞破碎機破碎后樣品的破碎率呢？一般來說有三種方法：

　　1）顯微鏡觀察法：即分別取相同量的破碎前的菌液樣品和破碎后的菌液樣品在顯微鏡下進行觀察，數數（根據情況選擇是否需要染色），分別數出破碎前菌液視野內的完整菌體數量A和破碎后菌液視野內的完整菌體數B，即可得出細菌破碎率。即：細菌破碎率=100%-B/A*100%

　　這種方法看似比較簡單和粗糙，但確實是現實當中一個非常常用，用得最多的一種方法。

　　2）電泳法：將破碎后的樣品去跑電泳可得到目的蛋白量A，再與理論目的蛋白量B進行對照即可得到破碎率，即：細菌破碎率=A/B*100%

　　當然，這種檢測方法是否準確有一個前提條件，即細菌的破碎過程中目的蛋白的活性沒有因為溫度或者其他因素而受到影響。

　　3）菌落培養法：將破碎后的樣品與破碎前的樣品取同樣的體積進行菌落培養，破碎后的菌液長出來的菌落數量記為A，破碎前的菌液長出來的菌落數量記為B，細菌破碎率= 100%  -A/B*100%

　　當然，這三種方法都需要做幾組對比實驗，取平均值來計算其破碎率。至于選用哪種方法則可根據實際情況進行選擇。

　　知道了細菌破碎的破碎率如何測定，那么高壓細胞破碎機所能達到的細菌的破碎率到底有多高呢？一般來說，大腸桿菌的破碎率可以達到至少95%以上，酵母菌的破碎率可以達到90%以上。當然，不同品牌的設備所需要的工藝也是不一樣的，大腸桿菌需要的破碎壓力一般在800ar~1500bar，破碎次數一般為1~3次；酵母菌需要的破碎壓力一般在1200bar~2000bar，破碎次數一般為3~5次。（后續在介紹不同品牌高壓均質機的時候會針對性的做具體說明）

　　第三， 溫度控制

　　在前面筆者講高壓細胞破碎機的工作原理時講到過，細菌在破碎的時候主要是受到爆破力，撞擊力和剪切力而起到破碎效果的，而這三個力中爆破力和撞擊力是最主要的。從能量學角度來看，細菌在經過高壓細胞破碎機的狹縫之前受到了非常高的壓力的擠壓，這個時候細菌所受到的能量全部是勢能，而從狹縫噴射出來時轉換成了一部分動能，另外很大一部分則轉換成了熱能。根據原理來看，所有的高壓細胞破碎機都會產生熱量，而且壓力越高時產生的熱量就越多，而由于生物蛋白都具有活性，高溫是萬萬不能容忍的，所以所有的高壓細胞破碎機要想在細菌破碎行業得到廣泛的使用就必須做好控溫措施。

　　關于高壓細胞破碎機的冷卻方式有很多種，也有幾個廠家有非常高效的冷卻系統設計，后續筆者會做詳細介紹。

　　感謝大家一直以來的支持和幫助，下一講筆者會主要講高壓細胞破碎機在結構生物學的應用，希望大家多提意見~