本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大鼠凝血素（Prothrombin）水平。用純化的大鼠凝血素（Prothrombin）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入凝血素（Prothrombin），再與 HRP 標記的凝血素（Prothrombin）抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉化成藍色。
1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。
2．不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟
1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。
2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣 50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl，然后再加待測樣品 10μl（樣品最終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。
4. 配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此重復 5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑 50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同 3。
8. 洗滌：操作同 5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
15 分鐘.
10. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
11. 測定：以空白空調零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應在加終止液后 15 分鐘以內進行。