一、材料
1. 無菌
（1）L-15 Leibovitz 培養液
（2）Ham F12 培養液或 WilliamE 培養液：80～100 ml，含有 0.2% 牛白蛋白（V 級，Sigma) 和 1 ug/ml 牛胰島素
（3）胞培養液（hepatocyte minimalmediu，HMM )：67.5% EMEM 和 22.5%199 培養液，或用 William E 培養液代替這兩種培養液。添加 5ug/ml 牛胰島素、lmg/ml BSA、20 mmol/L 丙酮酸鈉、100U/ml 青霉素、100 Mg/ml 鏈霉素和 20%FBS
（4）HMM/SF：無血清 HMM ，添加 10-5mol/L 氫化可的松半琥珀酸酯
（5）無鈣 HEPES 緩沖液：含有 160.8 mmol/L NaCl、3.15 mmol/L KCl、0.7 mmol/L Na2 HPO4·12 H2O 和 33 mmol/L HEPES，pH 7.65。用 0.22, 又微孔濾器過濾除菌，在 4℃ 條件下儲存，可存放 2 個月
（6）膠原蛋白酶液：含有 0.025% 膠原蛋白酶（I 級，Sigma; 或 Boche，103578) 和 0.075% CaCl2·2 H2O，用 pH 7.65 的無鈣 HEPES 緩沖液配制。使用前配制，并用濾器過濾除菌
（7）5% 戊巴比妥鈉（Abbott)
（8）肝素（Roche)
（9）聚乙稀管：內徑為 3 mm ，外徑 5 mm
（10）一次性 20 G 頭皮靜脈輸液針（Dubernard Hospital Laboratory，Bordeaux，France)
（11）插管用的縫合線
（12）刻度瓶和 Petri 培養皿
（13）手術器械：尖剪、直剪、彎剪和手術夾
（14）2 支二次性 1 ml 注射器
2. 非滅菌
（1）計時器
（2）蝠動泵：10～200r/min
（3）水浴箱
二、操作步驟
1. 用水浴箱將 HEPES 緩沖洗液和膠原蛋白酶液預熱，一般 38～39℃，進人肝內時為 37℃。不需要加氧。
2. 將螺動架的流速設定在 30 ml/min。
3. 腹膜腔注射戊巴比妥鈉（每 100 g 體重注射 150ul)，將大鼠（180～200 g ) 麻醉。然后，經股靜脈注射 10001U 肝索。
4. 用 70% 乙醇擦洗大鼠腹側面。
5. 切開腹壁，在離肝約 5 mm 處將結扎線系于肝門靜脈上。朝肝的方向插管后，結扎肝門靜脈。
6. 為了避免壓力過高，迅速剪開肝靜脈。以流速 30 ml/min 灌注 500 ml 無鈣 HEPES 緩沖液。幾秒鐘內確認肝變白。
7. 以流速 15 ml/min 灌注 300 ml 膠原蛋白酶液。肝變得腫脹。
8. 切除肝，用 HEPES 緩沖液沖洗。
9. 剝離 Glisson 囊后，用 100 ml L-15 Leibovitz 培養液分散細胞。
10. 用兩層紗布或孔徑為 60～80um 的尼龍網過濾細胞懸液。通常在室溫條件下，讓有活力的細胞沉淀 20 min 。然后，吸去 60 ml 含有細胞碎片和死細胞的上清液。
11. 通過緩慢離心（50 g，40s) 洗細胞 3 次，以除去膠原蛋白酶、損傷細胞和非實質性細胞。
12. 用 HMM 混懸分離的肝細胞。
13.2～3 h 后，活細胞會貼壁，并開始伸展。吸去含有死細胞的上清液。
14. 細胞貼壁后，用 HMM/SF 替代含有 FBS 的 HMM。此后，每天換培養液。
展開 | 