大鼠腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體1(DR-4)ELISA試劑盒
(用于血清、血漿、細胞培養上清液和尿液、唾液生物體液內)
原理
本實驗采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法。用抗大鼠 DR-4/TRAIL-R1 單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的 DR-4與單抗結合，加入生物素化的抗大鼠DR-4，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結合，加入底物工作液顯藍色，最后加終止液硫酸，在450nm處測OD值，DR-4濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中DR-4濃度。
試劑盒組成（2-8℃保存）
酶標板（Coated Wells） | 96孔 | 酶標抗體工作液（Enzyme Conjugate） | 12ml |
10×標本稀釋液（Sample Buffer） | 12ml | 20×濃縮洗滌液（Wash Buffer） | 50ml |
標準品（Standards）：60ng/瓶 | 2瓶 | 底物工作液（TMB Solution） | 12ml |
第一抗體工作液（Biotinylated Antibody） | 12ml | 終止液（Stop Solution） | 12ml |
準備試劑與收集血樣
1. 收集標本：血清、血漿（肝素抗凝）、細胞培養上清液、尿液、唾液等盡早檢測，2-8℃保存48小時；更長時間須冷凍（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反復凍融。血清、血漿作1：10稀釋（取20ul，加標本稀釋液180ul,稀釋10倍）。細胞培養上清可以不做稀釋直接檢測。
2. 標準品液配制：使用前加入3ml蒸餾水混勻，配成20ng/ml的溶液。設標準管8管，第一管加標本稀釋液900ul，第二至第八管加入標本稀釋液500ul。在第一管中加入20ng/ml的標準品溶液100ul混勻后用加樣器吸出500ul，移至第二管。如此反復作對倍稀釋，從第七管中吸出500ul棄去。第八管為空白對照。
3. 10×標本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。
4. 洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）
檢測程序
1. 加樣：每孔各加入標準品或待測樣品100ul，將反應板充分混勻后置37℃120分鐘。
2. 洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。
3. 每孔中加入第一抗體工作液100ul。將反應板充分混勻后置37℃60分鐘。
4. 洗板：同前。
5. 每孔加酶標抗體工作液100ul。將反應板置37℃30分鐘。
6. 洗板：同前。
7. 每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗處反應15分鐘。
8. 每孔加入100ul終止液混勻。
9. 30分鐘內用酶標儀在450nm處測吸光值。
結果計算與判斷
1. 所有OD值都應減除空白值后再行計算。
2. 以標準品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0 pg/ml為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上作圖，畫出標準曲線。
3. 根據樣品OD值在該曲線圖上查出相應DR-4含量，再乘上稀釋倍數即可。
試劑盒性能
1. 靈敏度：最小的DR-4 檢測濃度小于15pg/ml。
2. 特異性：可同時檢測重組或天然的大鼠DR-4。不與大鼠其它細胞因子有交叉反應。