細胞在培養瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續生長，同時也將細胞數量擴大，就必須進行傳代（再培養）。傳代培養也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養細胞進行各種實驗的必經過程。
懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經消化后才能分瓶。一般使用蛋白水解酶（比如胰蛋白酶）消化貼壁細胞成單個細胞，也可加入乙二胺四乙酸（EDTA）提高消化能力，EDTA 是一種二價離子的螯合劑，能抑制細胞膜上的Ca2+和Mg2+。常用的細胞消化液一般含有0.25%(w/v)的胰酶和0.03% (w/v) EDTA，一般用不含Ca2+和Mg2+的鹽溶液配置，先用胰酶-EDTA 消化液清洗細胞（5.0 -10.0 ml/75cm），然后棄去消化液，重新加入少量的胰酶-EDTA 消化液(2.0 to 5.0 ml/75 sq. cm flask)，觀察細胞直到細胞變圓脫離瓶壁，此過程一般需要5-15分鐘，為了避免細胞成團，消化細胞的過程中不要拍打細胞瓶。對于特別難消化的細胞，可以加入胰酶EDTA 消化液后把細胞置于37°C 促進消化，細胞脫離瓶壁后，立刻加入含有血清的完全培養基中止消化，血清中某些蛋白質能夠抑制胰酶的活性。
一般情況下，離心并不需要。如果細胞需要無血清或者低血清的培養基，可以以125000g 轉速離心5分鐘，然后棄去中止用的培養基，加入適合的新的培養基輕輕混勻細胞，移入到新的培養瓶。傳代的比例視細胞類型而定，一般是1:2-1:20，具體比例可參考說明書。胰蛋白酶會對某些細胞的細胞膜產生損傷，對于這種類型的細胞，可用細胞刮輕輕刮下細胞，加入適量的培養基，輕輕吹打混勻細胞，然后進行傳代培養。