一、材料
（一）儀器
1.
凈化工作臺
2.
離心機
3.
恒溫水浴箱
4.
冰箱（4℃、-20℃、-70℃）
5.
倒置相差顯微鏡
6.
培養箱
7.
液氮冰箱
（二）玻璃器皿
1.
吸管（彎頭、直頭）
2.
培養瓶
3.
玻璃瓶（250ml、100ml）
4.
廢液缸
（三）塑料器皿
1.
吸頭
2.
槍頭
3.
膠塞
4.
移液管（10ml）
5.
15ml離心管
6.
凍存管（1～2ml）
（四）其他物品
1.
微量加樣槍
2.
紅血球計數板
3.
記號筆
4.
醫用橡皮膏
5.
移液槍
（五）試劑
1.
D-Hanks液
2.
小牛血清
3.
培養液
4.
雙抗（青霉素、鏈霉素）
5.
胰蛋白酶（0.08%）
6.
1NHCl
7.
7.4%NaHCO3
8.
DMSO（分析純）或無色新鮮甘油
二、操作步驟
（一）細胞凍存
1.
配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養液；
2.
取對數生長期的細胞，用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來，懸浮生長的細胞則直接將細胞移至15ml離心管中、；
3.
離心1000rpm，5min；
4.
去除胰蛋白酶及舊的培養液，加入適量配制好的凍存培養液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數，調節凍存液中細胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml；
5.
將細胞分裝入凍存管中，每管1～1.5
ml；
6.
在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者；
7.
凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/
min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/
min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h
，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內。
（二）
細胞復蘇
1.
從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化。
2.
從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養液，混勻；
3.
離心，
1000rpm，5min；
4.
棄去上清液，加入含10%小牛血清培養液重懸細胞，計數，調整細胞密度，接種培養瓶，37℃培養箱靜置培養；
5.
次日更換一次培養液，繼續培養。
三、注意事項
1．從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養細胞都可以用于凍存，但最好為對數生長期細胞。在凍存前一天最好換一次培養液；
2．將凍存管放入液氮容器或從中取出時，要做好防護工作，以免凍傷；
3．凍存和復蘇最好用新配制的培養液。