同學們又是做qPCR實驗的一天，有沒有懷著忐忑又期待的心情去點開“analysis”的呢？點開之后，發現擴增曲線不正常，或者Cq值過大，又或者SD值太高，那這樣的實驗結果還靠譜嗎？現在讓小編來告訴你，qPCR實驗的成功與否，關鍵在于各組數據是否達到判定標準以及是否符合實驗預期，小小的qPCR實驗它可以變得很簡單，也可以變得很復雜，如何抓住qPCR數據分析的關鍵，是分析qPCR結果可信度的第一步。
qPCR數據分析的關鍵
qPCR數據分析主要是利用Cq值進行計算，所以我們需要了解qPCR反應中幾個重要的參數，根據參數的表現來進行實驗評估：
擴增曲線：圖1反映的是熒光信號變化量的對數與qPCR反應循環數的關系。圖2反映的是隨著qPCR反應的進行相應的熒光信號的變化，比較直觀，但是指數期很短。標準的擴增曲線是呈現出“S”型，具有特征性的形狀：首先背景信號，然后是三個增長階段（指數增長期、線性增長期和平臺期）。
圖1：擴增曲線對數圖譜。圖源：Azure Cielo qPCR系統。
圖2：擴增曲線線性圖譜。圖源：Azure Cielo qPCR系統。
基線：通常3-15個循環時，熒光信號變化不大，變化趨勢接近于一條直線，即擴增曲線的水平部分，這樣的直線就是基線。同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線。
閾值：是一個熒光強度值，穿過閾值與X軸平行的直線稱為閾值線，自動設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍。手動設置是置于指數擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強。同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。
Cq值：qPCR擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環次數，與起始濃度的對數成線性關系。分析定量時一般取Cq:15-35，太大或者太小都會導致定量的不準確。
圖3：擴增曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統。
評估qPCR反應的效果
1、擴增效率及相關系數
為了正確地評估PCR擴增效率，至少需要做3次平行重復，并至少做5個數量級倍數(5logs)連續梯度稀釋模板濃度。擴增效率E在90-110%之間時，認為擴增接近理想情況。
R2值：評估PCR效率的另一個關鍵參數，它是說明兩個數值之間相關程度的統計學術語。如果R2等于1，則可以用Y值（Cq）來準確預測X值（初始模板量）。反之，如果R2等于0，就不能通過Y值來預測X值。一般認為，標準曲線的R2值大于0.98時，兩個數值之間相關的可信度很好。
圖4：標準曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統。
2、重復性
重復性即是指精確度，反映多次測量值之間的接近程度。標準偏差（standarddeviation，偏差的平方根）是最常用的精確度計量方法。如果許多數據點都靠近平均值，那么標準偏差就小；如果許多數據點都遠離平均值，則標準偏差就大。例如，假設PCR反應效率是100%，那么2倍稀釋點之間的平均Cq間隔應該恰為1個Cq值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度，標準偏差就必須小于等于0.167。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋，標準偏差必須小于等于0.250。總的來說，重復孔之間的標準偏差不大于0.2，說明實驗的重復性較好。
圖5：8個重復孔的擴增曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統。
3、重現性
指不同批次之間或不同實驗室之間qPCR結果的變化，通常表示為拷貝數或Cq值的SD或CV。
圖6：4臺獨立的Azure Cielo 儀器上檢測GAPDH，Cq =20.11，SD= 0.002。
4、靈敏度
分析靈敏度是指一個樣本中可通過實驗精確測量的最小拷貝數，而臨床靈敏度是指在特定疾病患者們中，被檢測確定為陽性的百分比。靈敏度為limit of detection（LOD），即在給定的分析程序中，可以確定且合理（通常使用95%的概率）檢測得到的濃度，可通過梯度稀釋樣品來確定最低檢測限。LOD理論上最小是3 copy/aliquot，這是由遵從泊松分布的取樣誤差導致的。假設符合泊松分布，那PCR有95%的可能性至少包含和檢測到1個拷貝。
圖7：5個數量級的動態范圍檢測。圖源：Azure Cielo qPCR系統。
5、準確度
反映測量值和真實值的接近程度，以倍數變化或拷貝數進行估算。
6、特異性
指qPCR實驗中只可以檢測到目的基因，引物特異性擴增靶序列，而不會擴增其他基因序列。可通過凝膠電泳檢測擴增產物是否為單一條帶，或通過qPCR反應，根據溶解曲線是否具有單峰來判斷。
圖8：溶解曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統。
Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統
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Azure Cielo?性能展示
? 高重現性和穩定性
連續1000次實驗后，結果高度一致
GAPDH定量，Cq值=22.4±0.01
? 高重復性
重復孔的擴增曲線高度重合
96孔重復結果（GAPDH），Cq平均值=19.1，
變異系數（Cv）=0.002。
? 高分辨率
準確區分2倍濃度差異樣品
人內參cDNA（GAPDH）進行10個梯度，
2倍稀釋，3個重復，線性擬合度
R2=0.998，擴增效率E=99.89%