如何提高PCR產物克隆的效率

把PCR產物克隆到載體上常見有3種做法：

1.  直接克隆到T載體（或者U載體上）

2.  引物設計時引入酶切位點，PCR產物酶切后直接克隆到目標載體上

3.  將平末端PCR產物直接克隆到平末端酶切載體上。

方法3主要是針對高保真的聚合酶比如Stratagene公司的Pfu酶，NewEnglandBiolabs公司的Vent酶，以及QIAGEN公司新出的同時具有熱啟動功能的高保真ProofStart酶，進行PCR擴增，由于這類酶有很強的校讀功能，能夠以模版為準切掉錯配的堿基，因而得到的PCR產物多數是平末端，不能用T載體克隆。通常需用目的載體多克隆位點上的平末端單酶切位點，單酶切得到平末端的線性片斷，直接連接PCR產物。這類酶得到的產物通常不能用TA克隆試劑盒。目前也有商業化的平末端PCR產物克隆試劑盒，不過較少用。平末端的連接效率低，通常需要高濃度的連接酶，較長的連接時間，合適的片斷：載體比例，有的時候還需要調整反應體系的ATP濃度或者增加聚乙二醇（PEG2000），以得到較高的連接效率。許多廠家都有推出快速連接試劑盒，比如NewEnglandBiolabs新出的5分鐘快速連接試劑盒，能夠簡化平端連接步驟和條件，縮短連接時間，提高連接效率。

不過需要注意的是一些廠家（例如Clontech、Gibco/BRL、Roche）也生產一些用于PCR的高保真混合酶，是采用常規Taq酶和一些有校讀功能的（proofreading）的聚合酶按比例混合（這樣得到的混合酶的保真性比普通Taq酶高一點，但通常不如Pfu、ProofStart等酶），因而得到的PCR產物也是平端和A末端的混合產物，是否能用TA克隆試劑盒需要參考廠家的說明。

方法2是比較常用的經濟的方法，不需要購買T載體，可以直接通過酶切PCR產物，得到粘末端，直接連接到目的載體上。在順的時候，這種方法是非常簡單的。可有時候也會出問題，雙酶切就是連不上，比較常見的原因是PCR產物雙酶切不完全，比如沒有純化產物就直接雙酶切，有的酶比較“嬌氣”容易出現“切不動”或者是“星號活力”，得不到正常的粘末端而連不上。有時是因為選定的兩種酶反應條件相差比較大，為了省事同時雙酶切（通用Buffer不是一定通用的，不能過分迷信，有時會成為莫名其妙出錯的根源），也會出現類似的錯誤。還有一種情況是由于有些酶在酶切時需要一定的“占位空間”，也就是要求酶切識別序列的前后有一定數量的堿基才能正常酶切，而設計引物時酶切位點直接就在5'末端，沒有留下足夠的保護堿基而導致PCR產物酶切不動，無法正常的克隆。由于這些錯誤很難檢查，有的時候會浪費大量的時間，還是莫名其妙沒有結果。

由于常見的Taq酶或者沒有校讀功能的DNA聚合酶（即不是高保真）在PCR擴增的時候通常會在PCR產物末端多添加一個A（即增加一個模版上不存在的A）。這個突出的A成為PCR產物TA克隆技術的基礎。帶有互補的突出T末端的線性載體能夠有效提高PCR產物的克隆效率，解決方法2遇到的難題，所以方法1也是目前比較常見的方法。

TA克隆在順的時候也很簡單，簡直就是“apieceofcake”，不用考慮酶切位點，引物設計等等問題，好的載體克隆效率高、重組率高而且兩端有豐富的單酶切位點便于后繼的克隆，但是煩的時候也會出現無緣無故克隆不上或者重組率很低的問題。比較容易忽略的問題是用高保真的酶進行PCR擴增，應該選用平端克隆載體而錯用了TA載體。常見但很難解決的問題則是由于T末端容易和其他堿基錯配而導致自身環化或者克隆了引物/自身褪火引物二聚體或者PCR不完整產物，因而出現假陽性。因而QIAGEN公司推出了UA克隆試劑盒，用突出的U末端代替T末端，由于U堿基能夠有效減低和其他堿基（T、C、G）非特異退火的幾率，因而能有效提高PCR產物的克隆效率。

但是，是否還有其他因素會影響PCR產物的克隆效率呢？zui近，QIAGEN公司的研發專家發現，PCR引物5'端的堿基（也就是引物*個堿基）的不同，會影響PCR產物的克隆效率！以后設計引物可要注意了！看看QIAGEN的專家怎么說――

RalfPeist,DorotheeHosel,TheaTutjes,andDirkLoffert

基于UA的克隆技術廣泛應用于PCR產物的快速、簡便和高效的克隆。由TaqDNA聚合酶為PCR產物添加的多出來的一個A堿基能夠和pDriveCloningVector（QIAGENPCRCLoningKit提供）載體上的互補的U堿基配對結合。PCR產物能夠高效地結合到載體上，無需在引物中引入限制性內切酶位點，無需酶切或者平端連接。

在某些特殊情況下，由于一些未知的原因，一些表面很正常的PCR產物的克隆效率卻很低。在這里，我們證實：PCR引物的5'末端堿基能夠顯著影響TaqDNA聚合酶添加A末端的效率――有的時候導致只有一小部分PCR產物帶有A末端，從而使PCR產物克隆效率明顯降低。在這里我們提供一些簡單的建議如何提高這些“難克隆”的PCR產物的克隆效率。

材料和方法

GeneScan 分析以確定PCR產物的長短

用QIAGEN公司的QIAprepSpinMiniprep提取質粒pTZ19R。采用沒有校正功能的DNA聚合酶和特異性引物分別擴增質粒上的112bp、213bp和363bp片斷。每個片斷的擴增都分別進行4組反應，采用同一個熒光標記的正向引物（forwardprimer）和4個不同的反向引物之一進行擴增，4個reverseprimer的區別僅在于引物的5'端堿基分別為（A、T、G、C），其他序列都相同。PCR產物用ABIPRISM377測序儀分析，并用ABIGeneScan分析軟件進行分析。

分析克隆效率

用DNeasyTissueKit和QIAampDNABloodMiniKit分別純化小鼠和人類基因組DNA。用QIAGENTaqDNA聚合酶或者HotStarTaqDNA聚合酶分別擴增小鼠p53基因上一段500bp的片斷、人類prion蛋白基因上一段750 bp的片斷，以及人類白介素9基因上一段1000 bp的片斷。每個片斷的擴增都分別進行4個反應，分別采用4對引物（區別僅在于5'末端堿基分別為A、T、G、C，其他序列相同，如表1）進行擴增。PCR產物克隆到QIAGENPCR克隆試劑盒中的pDriveCloningVector中。計算克隆數，以其中一組5'端帶A堿基的克隆數為基準（normalizedto）進行比較,結果如圖。

表一：擴增人白介素9基因中1kb的一段序列的引物組合：

PCRfragment Forwardprimer ReversePrimer

A 5'-ACTC.  .  .  TGC-3' 5'-ACGC.  .  .  TGT-3'

C 5'-CCTC.  .  .  TGC-3' 5'-CCGC.  .  .  TGT-3'

G 5'-GCTC.  .  .  TGC-3' 5'-GCGC.  .  .  TGT-3'

T 5'-TCTC.  .  .  TGC-3' 5'-TCGC.  .  .  TGT-3'

結果和討論

1.  引物的5'末端堿基對添加A末端反應的影響

沒有校讀功能的DNA聚合酶如Taq酶，會在PCR產物的3'末端添加多一個A（即：比模版多加一個A）為了比較引物的5'末端堿基對添加A末端反應的影響，我們比較了3個不同片斷的各4組PCR產物的長短。結果表明：引物5'末端是A堿基的，PCR產物末端添加A的效率zui高。引物5'末端是G的，PCR產物末端添加A的效率也很高，但是反應時間的延長，會導致添加2個A，從而影響后繼的PCR產物克隆。

2.  引物5'末端堿基對PCR產物克隆效率的影響，以及連接時間對克隆的影響

既然引物的5'末端堿基的不同會影響PCR產物末端添加A的反應效率，我們也研究了這種現象對PCR產物克隆的影響。結果表明PCR產物克隆效率與添加單個A堿基的效率正相關，引物5'末端是A的PCR產物得到的重組陽性克隆（insert-bearingcolonies）zui高。不同長短的片斷克隆結果都證實了這一點。因此，引物設計時應該盡可能在5'末端添加A堿基。

如果引物設計時5'末端無法加A，延長連接時間能夠彌補克隆效率的不足。30分鐘的連接時間能夠保證引物末端帶A的PCR產物有足夠高的克隆效率。如果延長連接時間到2小時，能夠顯著提高引物末端帶C的PCR產物克隆效率。

結論

1.  QIAGENPCRCloningKit能夠簡單快速將PCR產物克隆到PCR載體中，采用QIAGEN試劑盒中特制的感受態細胞，只需要40分鐘可以完成從克隆到涂板的全過程。

2.  偶然，PCR產物克隆效率會意外的低，此時可以通過設計一對5'端帶A的引物（引物的*個堿基是A），這樣可以提高Taq酶在PCR產物末端添加A的效率，從而提高PCR產物在UA（TA）載體的克隆效率。

3.  如果不能在引物5'端加A，可以通過延長連接時間來提高克隆效率。