葡萄糖氧化酶法。
1．原理
葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下產生葡萄糖酸和過氧化氫，過氧化氫在過氧化物酶的作用下使鄰聯甲苯胺生成藍色物質，該有色物質在625 nm波長下與葡萄糖濃度成正比。通過側定藍色物質的吸光度值可計算樣品中葡萄糖的含量。
2．儀器
①實驗室常用設備。
②722型分光光度計。
3．試劑
除特殊說明外，實驗用水為蒸餾水，試劑為分析純。
①三氯乙酸(40％)：稱取4．0 g三氯乙酸，用水溶解并稀釋至100 mL。
②無水乙醇。
③2 mol·L-1NaOH溶液：稱取8 g NaOH，用水溶解并稀釋至100 mL。④1％鄰聯甲苯胺溶液：稱取0．1 g鄰聯甲苯胺溶解于10 mL無水乙醇中，倒人棕色瓶中，4℃冰箱保存。
⑤乙酸緩沖液(pH5．O)：稱取14．28 g乙酸鈉(CH。COONa．3H20)溶于水中，加入2．7mL冰乙酸，使pH為5．O，用水定容至1L。
⑥葡萄糖氧化酶溶液：稱取一定量的葡萄糖氧化酶(Sigma公司)用水溶解，使酶含量為100U／mL。4℃冰箱保存一周。
⑦過氧化物酶溶液：0．010 g辣根過氧化物酶溶于10 mL7J(~，4℃冰箱保存一周。
⑧酶溶液：取100 mL乙酸緩沖液，分別加入鄰聯甲苯胺溶液、葡萄糖氧化酶溶液、過氧化物酶溶液各l mL，混勻。4℃冰箱可保存7周。
⑨酶空白液：取100 mI。乙酸緩沖液，分別加人鄰聯甲苯胺溶液、過氧化物酶溶液各l mL，混勻。4℃冰箱保存1周。(注意酶空白液中不含葡萄糖氧化酶)
⑩葡萄糖標準液：將葡萄糖標準品(純度大于99％)于80℃干燥至恒量。精確稱取O·050 g，用水移人100 mL容量瓶中，定容至刻度線。此標準液相當于濃度為0．5 mg．mI。_。。
4．操作步驟
①樣品處理
a．固體樣品：稱取0．5～5 g已粉碎的樣品于錐形瓶中，加入50 mL水后沸水浴15 min。冷卻后，轉移至100 mL容量瓶中并用水定容至刻度，反復搖動混勻樣品，過濾，棄初始幾滴濾液。收集濾液，如果濾液澄清，可直接用于測定或稀釋后用于測定。如果濾液渾濁，吸取20mL濾液轉移至另一容量瓶中，加人無水乙醇至刻度。混合后靜置至少30 min，過濾，濾液用于測定。
b·液體樣品或少糖、淀粉等碳水化合物水解液：吸取2～10 mL樣品或水解液，加入4倍
量無水乙醇(使乙醇最終濃度為80％，以沉淀不溶性多糖和部分蛋白質)，混合。靜置至少30
min，過濾后濾液定容備用(如果過濾后濾液仍渾濁，或樣液體積過少，可于3 000 r／min離心15
min，上清液備用)。
c．新鮮牛乳等樣品：吸取0．5～2 mL樣品，用水稀釋，加入3 mL 40％三氯乙酸溶液(用于沉淀蛋白質)，用水定容至100 mL，過濾。吸取5 mL濾液，用2 m01．L一，NaOH調節pH至中性，用水定容至i0 mL，備用。
②測定
a-標準空白管的制備：在試管中加入0．5 mL水和5 mL酶溶液。
b·標準管的制備：5支試管中先分別加入葡萄糖標準液0．1、0．2、0．3、0．4、0．5 mL，再分別加入水0．4、0．3、0．2、0．1．0．0 mL，最后各加入酶溶液5 mL。
c·樣品空白管的制備：在試管中加人0．5 mI。樣品提取液和5 mI。酶空白液。
d·樣品測定管的制備：在試管中加人0．5 mL樣品提取液和5 mL酶溶液。
將上述各試管中溶液混合后于37℃水浴反應15 rain，625nm測定吸光度值。(注意：反應時間應嚴格控制，因葡萄糖與酶溶液的成色反應與反應時間密切相關，
5．計算
根據吸光度值求出葡萄糖標準曲線的回歸方程，采用插入法求出測定管中葡萄糖含量，再根據稀釋定容體積和稱樣量，計算出樣品中葡萄糖含量。
6．說明
①此法適用于谷類、乳類、飲料、酒類等食品樣品和血液樣品。檢出量為0．02 mg。
②此方法中的酶溶液只能和葡萄糖反應，特異性強，靈敏度高。
③如果樣品提取液為無色，不需做樣品空白。有色樣品或樣品提取液渾濁，則應做樣品空白以減少干擾。