如何研究lncRNA？三位科學家現身說法

　　人生如戲，相信長鏈非編碼RNA（lncRNA）也體會到了。之前一直遭冷遇，如今卻是萬人迷。其實，人類及其他哺乳動物的基因組轉錄了數萬條lncRNA。根據GenCode數據庫中最新版本的數據，人類基因組中包含16,000條lncRNA，產生了近28,000條轉錄本。再加上其他數據庫的數據，目前已知的lncRNA超過40,000條。

　　這些類似mRNA的轉錄本在各種基因調控水平和胚胎發育等生物學過程中發揮作用。越來越多的證據也表明，異常表達的lncRNA在多種疾病狀態中發揮重要作用，如癌癥。這些RNA盡管在十幾年前就已經發現，但只有少數分子的功能得到鑒定。

　　德克薩斯大學西南醫學中心的藥理學教授David Corey表示：“你必須從檢測非編碼轉錄本開始。”他的研究方向是將lncRNA作為藥物靶點。“我對這些數據庫不感冒，因為可能存在錯誤。他們可能檢測到你的細胞系中不存在的RNA或很少量的RNA。”

　　若并非全基因組范圍內的檢測，Corey博士通常利用定量PCR來檢測非編碼轉錄本。“如果我們認為那兒有一條非編碼轉錄本，我們就用5’和3’ RACE來擴增和檢測這些區域，”他說。“了解它的起始位點和終止位點是件好事，但不一定是必需的。如果你主要對功能感興趣，那么就不用了解全部情況，若存在重疊的轉錄本，檢測起來也比較困難。”

　　如果轉錄本的確存在，下一步則是利用逆轉錄來生成RNA，“或者購買一條適當長度的RNA，但是序列必須相同，”Corey博士說。“你必須使用完全相同的qPCR引物，否則失之毫厘，謬以千里。”

　　當然，與mRNA相比，分析這些lncRNA面臨獨特的挑戰。據ArrayStar的資深科學家Yanggu Shi介紹，lncRNA的豐度水平通常比mRNA低十倍，而且組織特異性高，近80%的lncRNA是組織特異的，但mRNA不到20%。lncRNA的注釋比較少，因為它們不編碼蛋白質。此外，一些lncRNA沒有poly(A)尾。它們大多位于細胞核中。“基于這些原因，我們需要一些特殊方法來分析和注釋，”Shi博士說。ArrayStar專門開發分析RNA表達和調控的工具，特別是調控性的非編碼RNA。

　　舉個例子，RNA測序通常產生4000萬條序列，但lncRNA的測序覆蓋度太低，不足以進行可靠定量。“利用這種方法，lncRNA測序至少需要1億條序列，比常規的mRNA測序要多得多，”Shi博士解釋道。“相比之下，芯片受低豐度轉錄本的影響沒那么大，且錯誤定量的幾率較低。”

　　據Shi博士介紹，ArrayStar的lncRNA芯片帶有許多注釋，得到實驗支持，并被許多文獻引用。比如，ArrayStar芯片曾出現在《Nature Cell Biology》的一篇論文中，說明三陰乳腺癌中的細胞質LINK-A lncRNA激活了常氧下的HIF1α信號通路1。

　　最近，lncRNA序列的系統分析也取得了很大進展。Broad研究院（現科羅拉多大學）的John Rinn博士系統分析了影響核定位的lncRNA序列。他們開發出一種大規模并行報告檢測（MPRA），可鑒定出38種人類lncRNA中與核富集相關的序列。這項成果于2017年9月發表在預印本網站bioRxiv上2。

　　“大規模并行報告檢測對DNA很有用，”Rinn博士說。“它們挖掘出一切看似活躍的東西，并確定哪些是真正活躍的。我們也需要類似的技術來研究RNA的核富集。因此，我們將100,000條寡核苷酸混合在一起，看看哪些能將細胞質的報告基團帶回細胞核。只要你選擇活躍或非活躍，我們就能將它們分開。”

　　利用這種方法，Rinn博士及其團隊鑒定出109個獨特且保守的核富集區，它們來自29個不同的lncRNA。他們還在核富集區中發現了兩個較短的motif，并利用單分子RNA熒光原位雜交（smRNA-FISH）進一步驗證了幾個區域是否足以影響核定位。

　　“對于RNA而言，這一切都歸結為結構，”Rinn博士說。“以研究最為透徹的RNA為例，端粒酶RNA（TERC）。它是生存所必需的。酵母和人類的端粒酶的大小和序列不同，但它們可以交換，仍然起作用。進化并沒有保留這個基因的序列，但保留了它的結構和結合伴侶。通過這種分析，我們可以改變序列，但保留結構，看看它們是否仍然能結合。”

　　Corey博士則在繼續尋找可能成為治療靶點的lncRNA。“目前，我們特別感興趣的是一個內含子中的重復擴增，它與Friedrich共濟失調相關聯，”他說。“如果我們能夠上調這個靶點，則有望治療這種疾病。”