試劑、試劑盒 XK26 40 柱SephacrylS-300 HR藍葡聚糖TM 緩沖液+0.1mol LKCl
實驗步驟
材料和設備
XK26/40 柱（PharmaciaBiotech,Inc*)
SephacrylS-300 HR(PharmaciaBiotech,Inc.)
藍葡聚糖
試劑
TM 緩沖液+0.1mol/LKCl
(配方，見“試劑的配制”，PP.131-138.)
操作裎序
1) 確定填料的用量。市售的 Sephacryl S-300 HR 膠是濃度為 2/3 填充床體積的漿狀物。因此，對于 180 ml 的柱子（直徑=2.6 cm，長=34 cm)，可從瓶中取出 270 mlS-300 的漿狀物。
注：裝填凝膠過濾柱時，填料床的均勻性非常重要。還應注意，進行髙分辨率分離時, 較細、較長的柱子要有效得多。
2) 在粗燒結玻板漏斗中，用數倍體積的 TM 緩沖液+0.1mol/L KCl 充分洗滌 S-300 膠。
注：操作時要溫和 (尤其在攪拌時), 以防易碎的膠粒破碎。
3) 溫和地將填料懸浮于 TM 緩沖液+0.1mol/L KCl 中，至終體積為所需填充床體積的 2 倍（360 ml)。
4)(此步可任選，但建議做）置漿狀的 S-300 膠于真空下脫氣數分鐘。此過程可去除介質和緩沖液中溶解的氣體。
5) 立起柱子，其上帶有儲液槽盛放 S-300 膠和緩沖液。要確保柱子絕對垂直。關閉柱底部的出口。
6) 于空柱中加入約為 1/10 柱體積的緩沖液（約 20 ml)。
7) 連續不斷地將漿狀的 S-300 膠注入柱子。
注：嚴防氣泡進入凝膠過濾柱，這一點很重要，即使是小氣泡也會毀壞柱子，如是就必須重新裝柱。
8) 靜置約 30 min, 然后打開柱底部的出口，讓緩沖液從柱中流過。
9)S-300 膠沉降完畢后，關閉柱底部出口，移走柱上的儲液槽，于填充床頂部接上柱液流接頭。注意，在上液流接頭接上柱之前，務必使其充滿緩沖液，否則就會由此液流接頭帶入氣泡。
10) 將上液流接頭與泵連接（當心氣泡），開始用泵裝壓柱子。先以層析樣品時所用的流速裝壓柱子（對本實驗中的柱子，流速為 100 ml/h)。裝壓時，要注意觀察填料的頂部，隨著填料頂部的下沉，下調上液流接頭，使之始終處于填料床的頂部。然后，當填料停止下沉后，將流速增至層析流速的 150%(對于 S-300 柱來說，即把流速增至 150 ml/h)。繼續壓柱（并調節上液流接頭，直至填料不再進一步壓縮。此時層析柱即裝填完畢，備用。
注：裝柱時，緩沖液中不必添加蛋白酶抑制劑和二硫蘇糖醇。但樣品上柱前，必須用至少為一個完整體積的含這些成分的緩沖液平衡柱子。
11）為檢驗柱子的性能，一個好的辦法是上一份 2 mg/ml 的藍葡聚糖樣品于新裝填的柱子進行層析。不要再原先上過蛋白質樣品的柱子上層析藍葡聚糖。用層析緩沖液（TM 緩沖液+0.1mol/L KCl) 制備 2 mg/ml 的藍葡聚糖溶液，過濾（用 0.22um 濾膜除去小的、不溶的藍葡聚糖顆粒。藍葡聚糖按約 2% 總柱體積的量（對于 S-300 柱，約 4 ml) 上樣，以 2.5 ml 為一管分部收集各組分。用藍葡聚糖進行的層析可提供以下信息：①空體積；②樣品稀釋程度;③柱的總體質量，這可通過肉眼觀察藍葡聚糖在柱中的下移情況來判定，由此可揭示柱床的不足之處。