肺炎衣原體肺部感染的臨床癥狀及X線表現均無特異性，不能和其他非典型肺炎相區別，尤其是肺炎支原體肺炎，故確診有賴于實驗室診斷。最可靠的方法是進行肺炎衣原體的培養，取鼻咽部或咽后壁拭子、氣管和支氣管分泌物、肺泡灌洗液等標本培養。但由于肺炎衣原體的培養要求高，一般實驗室難以做到。應用PCR試驗對上述標本進行檢測對診斷有很大幫助，但需要注意質量控制，防止出現假陽性結果。
微量免疫熒光試驗（MIF）是目前國際上標準的且是最常用的肺炎衣原體血清學診診斷方法。
