如何鑒定轉基因成分？

　　轉基因生物（Genetically Modified Organism，簡稱 GMO），是利用現代分子生物學技術改變基因組構成的生物，而非傳統的選擇育種，一般包括轉基因植物、 動物和微生物。轉基因食品就是利用上述的轉基因生物（包括植物、動物和微生物）加工而成的食品或食品添加劑。目前最受關注的絕大多數轉基因食品都來源于轉基因植物。

　　2014年5月27日，農業部即下發通知要求加強農業轉基因生物安全監管，全面部署進一步加強農業轉基因生物安全監管工作。農業轉基因生物安全監管工作事關糧食安全、食品安全和生態安全。農業部高度重視，不斷健全制度，強化監管。

　　《中共中央國務院關于落實發展新理念加快農業現代化實現全面小康目標的若干意見》中指出：強化現代農業科技創新推廣體系建設。加強農業轉基因技術研發和監管，在確保安全的基礎上慎重推廣。《中共中央國務院關于積極發展現代農業扎實推進社會主義新農村建設的若干意見》中強調：嚴格執行轉基因食品、液態奶等農產品標識制度。啟動實施農產品質量安全檢驗檢測體系建設規劃。

　　轉基因成分鑒定整體方案包括：QuantStudio系列實時熒光定量PCR平臺和QuantStudio 3D芯片式數字PCR平臺用于快速篩查和檢測， 3130/3500/3730/SeqStudio系列基因分析平臺和Ion Torrent高通量測序平臺用于驗證和確認。

　　不同平臺的具體應用和特點：

　　1、QuantStudio系列實時熒光定量PCR平臺

　　對于 GMO 的檢測，目前最常用的是 qPCR 方法。篩選檢測為檢測通用的啟動 子與終止子序列，特異性品系檢測為檢測編碼區域序列。對于未知的品系，需先對編碼區進行測序，然后設計特異的引物探針進行檢測。為了避免假陽性，可通過對 PCR 產物測序而進行最終的確認。

　　普通的單重熒光定量PCR檢測存在實驗成本高，多靶點檢測操作復雜的問題，而多重熒光定量PCR又存在各項檢測彼此干擾，實驗條件難優化的難題。所以，常規的熒光定量PCR技術并不適合對復雜的轉基因作物進行高通量的篩查與檢測。TaqMan微流體熒光定量PCR芯片技術，采用Quant Studio 7 Flex實時熒光定量PCR平臺運行，是一種簡單、快速、靈敏、準確、有效的方法，可以同時對多個轉基因樣品，多個轉基因靶點進行高通量的檢測。

　　TaqMan微流體熒光定量PCR芯片技術的應用實例——轉基因玉米檢測

　　在這項實驗中，在實現轉基因樣品多樣品、多靶點高通量篩查的同時，有效地克服了PCR擴增效率低下，手工操作步驟多所帶來的高錯誤率等問題。

　　18種玉米轉基因標準物質通過商業渠道獲得(American Oil Chemists Society及Sigma/Aldrich, China)。16個真實玉米轉基因樣品來源于日常檢測所收集的陽性樣品，包括玉米粉、玉米粒、玉米膨化粉和玉米酒精糟可溶物。

　　將玉米的兩個內源基因(hmg和ADH基因)，一個內部上樣質控基因(18S基因)及18個外源重組靶點(TC1507，NK603，MON87640，MON863，MON810，MIR162，LY038，GA21，DAS40278，BT176，BT11，98140，59122，3272，MON89034，MIR604，MON88017和T25)共21種不同的引物和探針組合預先包埋在TaqMan微流體芯片上，對每個項目進行單重熒光定量PCR反應與檢測。芯片可一次檢測7個樣品及一個陰性對照，或6個樣品和1個陽性對照及1個陰性對照。

　　? 靈敏度：18種轉基因品系的檢測靈敏度都能達到1%，而其中12個轉基因品系的靈敏度能夠達到0.1%。

　　? 特異性：18種轉基因品系都能特異性檢出。

　　? 針對16個真實的玉米轉基因樣品，利用TaqMan微流體芯片的檢測結果與常規熒光定量PCR檢測結果進行比較，所有受試樣品的芯片檢測結果與常規熒光定量PCR的檢測結果完全一致。

　　2、QuantStudio 3D芯片式數字PCR平臺

　　2017年2月28日發布，2017年9月1日實施的國標GB/T 33526-2017“轉基因植物產品數字PCR檢測方法”中規定了轉基因成分檢測的數字PCR方法，適用于玉米、大豆、油菜、水稻、馬鈴薯、苜蓿、棉花等轉基因植物及其產品的轉基因成分數字PCR檢測，所能達到的檢測低限為0.1%。國標中指出，數字PCR其技術原理是通過將原始PCR反應體系進行分割，進而對所有小的反應體系進行擴增并后續檢測。通過對反應體系進行有限的分割，從而使整個反應體系可以更加耐受核酸抑制因子，并且更加穩定、準確、快速地對痕量的轉基因成分進行精準鑒定。其中芯片式數字PCR通過微流控芯片實現對原始反應體系的分割，這種分割方式具有穩定性好、均一性好的優點。QuantStudio? 3D Digital PCR系統采用芯片式數字PCR原理，能夠簡潔、快速、準確地完成轉基因的檢測和定量。

　　QuantStudio 3D芯片式數字PCR的應用實例——轉基因大米檢測

　　在這項實驗中，一張芯片完成了轉基因元件和內源基因的雙重PCR反應以及定量，且檢出了萬分之一數量級的轉基因成分。QuantStudio 3D數字PCR系統可以從大量非轉基因的基因組里檢測出混雜的極低含量的外源基因。在這項實驗中按照質量百分比在非轉基因大米中混入了2%和0.01%的轉基因大米。取一定量大米研磨成粉狀后，使用專門針對植物樣本核酸提取的磁珠法試劑盒進行核酸提取。之后進行數字PCR實驗。這項實驗中同時檢測了FAM熒光標記的植物基因工程中常用的胭脂堿合成酶終止子外源基因(NOS)，以及HEX標記的水稻的內源基因磷脂酶D基因(PLD)。結果顯示該樣品的轉基因拷貝數占總基因組的實際檢測值為0.017%和3.155%。

　　傳統熒光定量PCR能夠進行GMO的檢出和定量，但其不足也非常明顯：DNA樣品需要較高的品質要求，定量結果要求PCR反應的效率接近100%，標準品價格昂貴，絕對定量標準曲線的實驗較繁瑣，且對于低濃度的GMO混雜樣品檢測靈敏度不高。與之相反的是，數字PCR已被證實對DNA樣品中的PCR抑制物不敏感，而且對于低濃度的樣品定量也非常準確。這使得數字PCR在GMO檢測領域具有很高的實際應用價值。基于QuantStudio 3D的GMO檢測和定量技術在服務于GMO研究、檢測以及監管的各級機構正在獲得越來越廣泛的應用。

　　3、3130/ 3500/ 3730/ SeqStudio系列基因分析平臺

　　為了避免PCR結果的假陽性，可通過對 PCR 產物測序而進行最終的確認。應用3130/ 3500/ 3730/ SeqStudio系列基因分析平臺，可進行針對轉基因目標序列的的金標準測序，對轉基因成分進行準確驗證。

　　基因分析平臺的應用實例——水稻轉基因系的確認

　　香稻因其香味宜人而備受世界青睞。一個編碼甜菜堿醛脫氫酶（BADH2）的badh2等位基因的缺陷的存在導致2-乙酰基-1-吡咯啉(2AP)的合成，它是一個主要的香氣化合物。在這里，轉錄因子效應的核酸酶（TALENs）通過轉基因的方法靶向并破壞OsBADH2基因。從20個轉基因潮霉素抗性株系中恢復了六個雜合突變體（30%）。通過Sanger測序法確認了這些株系在TALEN靶點有各種各樣的插入缺失突變。同樣通過Sanger測序法確認了所有這六個株系都將BADH2基因突變傳遞至了T1代；四個T1代突變系也有效的將突變傳遞到T2代。這些結果表明通過轉基因的方式使用TALENs進行定向誘變是一種創造重要農藝性狀的有用方法。

　　4、Ion Torrent高通量測序平臺

　　為了避免PCR結果的假陽性，可通過對 PCR 產物測序而進行最終的確認。應用Ion Torrent高通量測序平臺，利用靶向基因組測序數據可以進行轉基因目標序列的快速鑒定和確認。