一、材料
無菌
D-PBSA
PE:10 mmol/L EDTA (溶于 PBSA)
胰蛋白酶：0.12% (溶于 PE)
BUdR(Sigma): 用無菌純水制備 1 mmol/L 儲備液
Karyomax: 秋水仙酰胺，10ug/ml (Invitrogen)
培養基
非滅菌
2 x SSC: 將 20 x SSC 1:10 稀釋
低張緩沖液：0.075mol/LKCl
Sorensen’s 緩沖液：磷酸緩沖液，0.066 mol/L , pH 6.8 (Merck 的小袋)
甲醇：乙酸（3:1)，置于冰上，新鮮配制
姬姆薩溶液，0.76 %：將 lg 姬姆薩粉末（Merck) 置于 66 ml 甘油中，56～60℃ 水浴 1.5～2 h ，待溶液冷卻后，加人 66 ml 無水乙醇
姬姆薩：用 Sorensen’s 緩沖液稀釋到 3.5%, pH 6.8
Hoechst33258 (Sigma)：20ug/ml (溶于超純水）
乳膠照相封固劑或黏合劑
二甲苯
DPX 封膠（Merk )
22 cm X15 mm 蓋玻片
科普林缸
載玻片（ ThermoElectron )
短波紫外燈及照射盒
安全提示 : Hoechst 33258 具有致癌性，要在通風櫥中稱量與溶解。
二、操作步驟
預處理
1. 以適當密度（如 75 cm2 培養瓶中接種 1X106 細胞）接種細胞，37℃ 孵育 2 天。
2. 將 BUdR 加入培養基，終濃度為 10umol/L 。
3. 將細胞繼續在 37℃ 避光孵育 48 h (約 2 個細胞周期）。
4. 依據細胞周期時間的不同，在收獲前 1～6 h 加人秋水仙酰胺。對于人細胞系，秋水仙酰胺的終濃度應為 0.01ug/ml。
收獲細胞
5. 用 D-PBSA 清洗細胞，用 PE 配制的 0.12% 胰蛋白酶 lml 消化細胞。
6. 用 10 ml 培養基重懸細胞，將細胞懸液移至 50 ml 離心管中。
7.1200 g 離心 5 min 。
8. 吸去上清，在沉淀上方留下約 1.2 ml 上清。以手指輕彈管壁，重懸沉淀。
9. 緩慢加入 10 ml 低張緩沖液（預熱至 37℃)，室溫孵育細胞懸液 10～15 min 。
10. 用臺式離心機 1200 g 離心 5 min 。
11. 吸去上清，在沉淀上方留下約 1.2 m l 上清。輕彈管壁，重懸沉淀。
12. 加入 10 ml 冰冷的固定液，最初逐滴加人，每加入一滴都要充分混勻。冰上放置 10 min。
13. 重復第 10～12 步，將細胞留在固定液中 4℃ 過夜，以改善制片效果。
14. 將固定的細胞 1200 g 離心 5 min ，用 3～5 ml 甲醇/乙酸重懸細胞。
15. 將細胞儲于一 20℃。
制片效果
16. 載玻片應保證潔凈并沒有油脂，因此使用前用無水乙醇擦一擦。
17. 用一根短的巴斯德玻璃吸管，吸取約 500ul 固定過的細胞。
18. 拿住載玻片，使其斜向下方。手持巴斯德吸管，在載玻片上方至少 15 cm 處，滴 3 滴細胞懸液在玻片上（見方案 16. 7)。
19. 避光，空氣中晾干載玻片。
20. 在相差顯微鏡下檢査載玻片，確保載玻片上中期細胞分布均勻，并且染色體分散良好。
花斑染色
21. 將載玻片浸人盛有 20ug/ml Hoechst 33258 的科普林缸中，放置 10 min(Hoechst 有毒性，操作時要戴手套） 。
22. 將載玻片轉移到玻片架上，每片上滴 500ul 2XSSC。
23. 將 22 mm x 50 mm 蓋玻片蓋在載玻片上，周圍用暫時性的黏合劑封上，以防蒸發。
24. 將載玻片放在玻片架上，蓋玻片朝下，將玻片架放入短波紫外盒載玻片與紫外光源之間保持大 約 4 cm 的距離。載玻片在紫外光下暴露的時間越長，形成的淺色染色體也就越淺。將載玻片暴露在紫外光下約 25～60 min。 25. 將載玻片上的蓋玻片拿開，用超純水清洗載玻片 3 次，每次 5 min。用鋁箔包裹玻片架。
26. 避光，空氣中晾干載玻片。
27. 將載玻片放入盛有 3.5% 姬姆薩溶液（用 Sorensen 緩沖液配制，pH 6.8) 的科普林缸中，染色 3～5 min 。
28. 用自來水小心漂洗載玻片，用吸水紙吸去水分。
29. 將載玻片在實驗臺上放置 1 h ，晾干。把載玻片在二甲苯中浸一下，每張載玻片上滴 4 滴 DPX 封膠（Merk )，將一張 22
mmX50 mm 蓋玻片緩慢放下，用吸水紙將氣泡排出（最后一步要在通風櫥中進行操作，因為二甲苯的氣霧有毒，另外也要戴手套）。
30. 載玻片放在通風櫥中過夜，晾干
分析
31. 在 40X 物鏡的光學顯微鏡下，篩選出有中期分散染色體的載玻片。
32. 載玻片上找出一個中期分散染色體分布最多的區域，然后在油鏡下觀測。
33. 如果沒有姐妹染色單體交換 （SCE)
發生，那么每條染色體都有一個連續染色的淺色染色單體以及一條連續染色的深色染色體。如果一條染色單體上有一深染區，然后是一淺染區，那么其姐妹染色單體
上就為一淺染區，然后是一深染區，這樣就表示發生了一處姐妹染色單體交換 。一個在染色上不連續的點計做是一個姐妹染色單體交換。
34. 對每個細胞內的姐妹染色單體交換的數目以及每個細胞內的染色體數進行計數。
35. 大型染色體的姐妹染色單體交換的數目通常比小型染色體的要多。此外，不同細胞的姐妹染色單體交換的發生率也有所不同，因而，對每條染色體的姐妹染色單體交換進行評分是測定姐妹染色單體交換速率的一種更準確的方法。姐妹染色單體交換分數按以下公式計算：  對于每個要研究的細胞系力求要對大約50個分散的分裂相進行計分。 | 