摘要 質譜是定量蛋白組學的主要工具。近年來隨著定量蛋白質組學研究的深入,傳統質譜定量技術面臨著復雜基質干擾、分析通量限制等諸多問題。而最近一系列質譜新技術的發展,包括同步母離子選擇(SPS)、質量虧損標記、平行反應監測(PRM)、多重累積(MSX)和多種全新數據非依賴性采集(DIA)等,為解決目前蛋白質組學在相對定量和絕對定量分析方面的局限提供了有效途徑。本文對定量蛋白質組學目前遇到的瓶頸問題進行了分析,總結了質譜定量采集技術的最新進展,并評述了這些新技術的特點以及在定量蛋白質組學應用中的優勢。
關鍵詞 定量蛋白質組學; 同步母離子選擇; 平行反應監測; 數據非依賴性采集; 綜述
1引言
當今蛋白質組學的關注焦點和研究趨勢已經逐漸從定性分析轉向定量分析。定量蛋白質組學是對細胞、組織乃至完整生物體的蛋白質表達進行定量分析,對生物過程機理的探索和臨床診斷標志物的發現與驗證具有重要意義[1,2] 。定量蛋白質組學分為相對定量與絕對定量[3] 。相對定量即差異比較,通過質譜大規模、高通量地對兩種或多種不同生理、病理條件下的樣本進行定量分析,獲得蛋白質表達量的精確差異,主要方法有穩定同位素標記和非標記兩種技術手段[4,5] 。絕對定量即獲得蛋白的具體表達量,利用質譜監測目標蛋白的專一性肽段(Unique Peptide)獲得色譜-質譜峰面積,并與已知量的標準肽段(外標法)或穩定同位素標記的重標肽段(內標法)比較確定具體量,實現絕對定量。主要質譜方法是對專一性肽段進行選擇反應監測或稱多反應監測(Selected/ Multiple reaction monitoring, SRM/ MRM)[6] 。
穩定同位素標記技術是蛋白質組學相對定量的經典方法。樣本在穩定同位素標記后、質譜分析前混合,一次分析實現差異定量,有效消除了色譜和質譜分離分析過程中的不穩定性,最大程度減小了定量誤差。常見方法有基于代謝標記的SILAC[7] 、基于酶解標記的18 O 標記[8] 和基于化學標記的二甲基化[9] 等,這些方法通過一級母離子提取峰面積實現定量比較。但是,一級定量具有標記通量低、動態范圍差、靈敏度不高等不足,因此, 近年來,基于同重同位素標記的二級定量方法使用越來越廣泛[10] 。利用同重同位素標簽標記肽段,在一級質譜不同樣本的肽段分子量沒有區分,相互疊加,提高了靈敏度;二級碎裂獲得分子量不同的報告離子,在b/ y 離子定性的同時,通過報告離子之間的強度差異實現定量,提高了動態范圍。同重同位素主要標記試劑有iTRAQ[11] 和TMT[12] ,標簽容量分別達到了8 標和6 標。然而,同重同位素標記技術面臨共洗脫肽段干擾的問題。蛋白質組學樣本非常復雜,在色譜上存在大量共洗脫肽段,而質譜在選擇母離子進行二級分析時,選擇窗口通常在m / z 2 左右,分子量接近的共洗脫肽段被同時選擇,碎裂出的報告離子與目標肽段報告離子疊加,降低了定量比例的準確性[13,14] 。Ting 等[15] 研究證明,在復雜樣本中,共洗脫肽段嚴重干擾了報告離子的強度,造成肽段和蛋白的定量比例低于真實比例,產生“低估效應冶。這一問題已成為同重同位素標記定量技術的瓶頸。
基于三重四極桿的SRM(或稱MRM)是質譜定量的金標準,在蛋白質絕對定量中也廣泛使用[6] 。SRM 根據專一性肽段的母離子質量和子離子質量,第一級質量分析器(Q1)篩選母離子,進入碰撞池碎裂后,第二級質量分析器(Q3)再篩選子離子,最大程度地去除干擾離子,監測母離子-子離子形成的離子對的信號響應。通過外標法,利用已知量的標準肽段繪制標準曲線; 或內標法,直接加入已知量的同位素重標肽段同時監測,從而實現定性確證和定量檢測[6,16] 。SRM 靈敏度高、線性范圍廣,是目標蛋白驗證和絕對定量的有效手段。然而,隨著定量蛋白質組學的深入發展,樣本基質越來越復雜、目標蛋白豐度越來越低,容易受到高豐度蛋白的掩蓋。而SRM 由于質量分辨率低,難以有效去除復雜基質背景的干擾,易造成假陽性[17,18] 。另一方面,隨著分析通量的要求越來越高,一次分析可能需要監測成千上萬個離子對,而SRM 速度和靈敏度的局限使得能同時監測的離子對數量有限[19] ; 此外,離子對、碰撞能量等條件的優化也費時費力,難以滿足目標蛋白質組學高通量發展的需要,特別是大樣本量的生物標志物和系統生物學研究[20,21] 。因此,蛋白質絕對定量同樣面臨著較大的技術挑戰。
近兩年來,隨著以Orbitrap 為代表的高分辨質譜硬件技術不斷進步、采集方法不斷創新,定量蛋白質組學遇到的諸多瓶頸正逐步得到解決。這些技術包括基于同重同位素標記技術的同步母離子選擇和質量虧損標記,相對于傳統SRM 掃描的高分辨平行反應監測和多重累積-平行反應監測,以及多種全新數據非依賴性采集技術。
2同重同位素標記進展:同步母離子選擇與質量虧損標記技術
以iTRAQ 和TMT 為代表的同重同位素標記技術面臨著兩方面的技術瓶頸:(1) 大量共洗脫肽段對定量準確性的影響:分子量接近的共洗脫肽段與目標肽段共同選擇并碎裂,報告離子疊加,造成實際定量比例不能準確反映真實結果[13 ~15] ; (2) 等重同位素標簽通量有限:以iTRAQ 為例,其報告基團(N-methylpiperazine)由6 個C 和2 個N 組成,因此容量上限為8 標,無法完成更高通量樣本的分析[22] 。而通過增大報告基團來提升標簽容量又會造成靈敏度的下降[23] 。
為解決共洗脫肽段干擾的問題,Ting 等[15] 使用LTQ-Orbitrap 進行MS3 掃描,對TMT 標記的樣本進行分析(圖1)。其中MS2 使用能量較低的CID (35%)碎裂,獲得b/ y 離子碎片用于序列鑒定,同時確保了TMT 標簽不會過多碎裂。在母離子m / z 110 ~160% 的范圍內,選擇最強的一個碎片離子,進行高能量HCD (60%)碎裂和MS3 檢測,使報告基團充分碎裂,獲得報告離子比例信息。結果表明,通過母離子和子離子雙重篩選,共洗脫肽段的干擾能夠被徹底去除,獲得的定量比例與理論比例一致。例如,在摻入等比例人源蛋白的不同比例酵母全蛋白樣本中,理論比值為10頤1,傳統MS2 測得的比值僅約為3,而MS3 測的比值為11. 7,與理論比值非常接近。
但是與傳統MS2 方法相比,MS3 信號強度明顯降低。因此,雖然MS3 的定量準確度大大提高,但定量靈敏度卻明顯下降,也使得MS3 定量方法并沒有普遍應用到實際分析中[24] 。此外,近來發展的TMT互補離子(TMTc) [25] 和QuantMode[26] 等技術雖然也能降低共洗脫肽段的干擾,但過程較為繁瑣,準確度無法與MS3 方法相媲美。
圖1MS3 定量方法示意圖[15] :(A) MS3 方法質譜采集過程; (B) MS3 與傳統MS2 方法結果對比
Fig. 1Schematic elucidation of MS3 method[15] : (A) Acquisition workflow of MS3 ; (B) Comparison of MS3 and classic MS2 results.
