同步母離子選擇(Synchronous precursor selection, SPS)技術的出現徹底解決了MS3 響應弱的問題。SPS 技術利用多頻切跡的選擇波形電壓(MultiNotch) [27] ,在線性離子阱中實現一次選擇同時獲得多個離子,最多可同時選擇15 個(圖2A)。利用這一原理,SPS 技術在MS2 中同時選擇目標肽段的多個b/ y碎片進行MS3 分析,產生的報告離子相累積,使MS3 信號響應大幅提高(圖2B)[24,28] 。實驗結果表明,使用SPS 進行MS3 定量分析,即二級CID 碎裂,并同時選擇多個碎片離子進行三級HCD 碎裂和Orbi-trap 檢測,獲得的MS3 譜圖響應與傳統MS2 譜圖相當,定量成功率超過70%,與傳統MS2 定量結果相當(圖2C)[24,28] 。同時,多個碎片報告基團的疊加相比傳統MS3 單個碎片報告基團,得到的比值更加穩定,定量重現性和準確度進一步增加(圖2D)。此外,相比傳統方法,MS3 定量方法只能用于Lys-C 酶解樣品,SPS MS3 定量方法適用于廣泛使用的Trypsin 酶解樣品,能更普遍用于常規定量蛋白質組學[29] 。Weekes 等[30] 使用SPS MS3 技術定量研究了巨細胞病毒(CMV)感染纖維母細胞的過程和機理,獲得超過8000 個蛋白(包括1184 個細胞表面蛋白)在8 個時間點感染過程中的精確定量變化,實現了實時動態定量分析,開創了定量時序病毒組學(Quantitative Temporal Viromics)領域的先河。
圖2 SPS MS3 定量方法示意圖[24,28] :(A) SPS MS3 方法質譜采集過程; (B) 傳統MS2 、MS3 、SPS MS3 對報告離子的影響; (C) MS3 、SPS MS3 定量靈敏度對比; (D) 傳統MS2 、SPS MS3 定量準確度對比
Fig.2 Schematic elucidation of synchronous precursor selection (SPS) MS3 method [24, 28] :(A) Acquisition workflow of SPS MS3 ; (B) Influence of classic MS2 ,MS3and SPS MS3 for reporter ion intensity; (C) Comparison of sensitivity of MS3 and SPS MS3 ; (D) Comparison of accuracy of classic MS2 and SPS MS3
對于同重同位素標簽通量的限制,Dephoure 等[31] 嘗試使用3 標SILAC 結合6 標TMT,同時定量18 組平行樣本,取得了良好的效果。而近年來,質量虧損標記技術的運用,從根本上拓展了報告基團的標簽容量。13C 和12C、15N 和14N 之間因核結合能形成質量虧損,巧妙利用13C14 N 與12C15N 之間6. 32 mDa的微小質量差,通過13C 與15N 相互替換,即可實現標簽容量上限的突破(圖3A)。例如,將TMT 6 標中TMT127、TMT129 報告基團上一個13 C 替換成15 N,形成TMT127L (12 C8 H16 15N1+ , 127. 1247608 Da) /TMT127H (12C713C1H1614N1+ , 127. 1310808 Da), TMT129L (12C613C2H1615N1+ , 129. 1314705 Da) /TMT129H (12C5 13C3H16 14N1+ , 129. 1377904 Da),標簽容量提升至8 標[32] 。類似地,在不改變報告基團結構的情況下,TMT 10 標、TMT 18 標均得以實現,有效解決了多組平行樣本的定量分析問題[33, 34] 。但是另一方面,6.32 mDa 的質量差異需要質譜在m / z 100 ~200 范圍達到50000 以上的分辨率才能實現基線分辨(圖3B),普通高分辨質譜難以勝任[33] 。而基于傅里葉變換原理的超高分辨Orbitrap 和FT-ICR,分辨率與m / z 成反比,能夠輕松分辨m / z 100 ~200 的質量虧損標簽[34] 。目前,基于質量虧損標記的TMT 10 標已經商品化,廣泛應用于系統生物學和臨床標志物研究等大樣本量的定量蛋白質組學(圖3C)。
圖3質量虧損標記提升標簽通量[33] :(A) 質量虧損標記原理(TMT-10); (B) 區分6 mDa 所需的質量分辨
率; (C) 質量虧損報告離子質譜示意圖(TMT-10)
Fig. 3Increasing labeling capacity by mass defect isotopes [33] :(A) Principle of mass defect labeling (TMT-10);(B) Minimum resolution for discrimination of 6 mDa mass difference; (C) Mass spectrum of mass defect reporter ions(TMT-10)
近年來,以同步母離子選擇SPS 和質量虧損標記為代表的新技術的發展,使得傳統同重同位素標記定量面臨的諸多問題正逐步獲得解決,成為蛋白質組學相對定量的有力工具和發展趨勢。
3目標蛋白定量進展:平行反應監測與多重累積
SRM 使用低分辨四極桿進行兩級離子篩選和監測,在小分子分析中能有效區分目標化合物和基質背景,因為小分子的化學結構通常差異較大[35] 。然而在蛋白質組學中,由于肽段性質的相似性,SRM 難以完全排除復雜樣本的背景離子,容易受到較大干擾,影響蛋白絕對定量的準確性和專一性[17,18] 。此外,SRM 還需要花費相當的精力進行離子對的選擇和優化[36] 。質譜技術的改進也為SRM 帶來改善。高分辨SRM (H-SRM)將四極桿的母離子選擇窗口從傳統的m / z 0. 7 縮小到m / z 0. 2, 從而有效地降低基質背景的干擾[37,38] 。然而,選擇窗口縮小也同時降低了選擇效率,因此該技術更多應用于小分子分析。此外,通過增加第三級質量篩選形成三級MRM (MRM3 )掃描,也有效提高了選擇性[39] 。但是MRM3 面臨著同樣的問題,額外一級離子篩選降低了檢測靈敏度,同時也增加了循環時間。
四極桿-高分辨串聯質譜技術的發展和掃描速度的提升,為目標蛋白定量提供了新的途徑。平行反應監測(Parallel reaction monitoring, PRM)正是相對于傳統SRM 建立起來的高分辨離子監測技術[40,41] 。PRM 基于以Q-Orbitrap 為代表四極桿-高分辨質譜平臺,與SRM 每次掃描一個Transition 不同,PRM 每次對一個母離子產生的所有Transition 進行全掃描,即平行監測了一個母離子對應的所有離子對。首先,PRM 使用四極桿(Q1)選擇母離子,選擇窗口通常m / z 臆2; 然后,母離子在碰撞池(Q2)中碎裂,形成子離子; 最后,以Orbitrap 取代Q3,對所有子離子進行高分辨/ 高質量精度(HR/ AM)的全掃描,完成PRM 采集(圖4)[42] 。相比傳統的SRM,PRM 的優勢在于:(1) 高分辨子離子監測,質量精度達ppm 級(通常外標法<3 ppm,內標法<1 ppm),在不損失靈敏度的情況下,最大程度地排除了背景干擾; (2)二級為全掃描,無需事先確定離子對和優化碰撞能量,只需要在數據處理時選擇響應最高的一個或幾個子離子,即可提取母子離子對的色譜峰進行定量,線性范圍可達5 ~ 6 個數量級; (3) 同時定性與定量分析,二級全掃描譜圖用于定性分析,選擇其中最佳的子離子提取離子對即可完成定量分析。
Peterson 等[40] 利用14 條標準肽段比較了SRM和PRM 兩種掃描方式的選擇性和靈敏度,結果表明在無基質的情況下,SRM 和PRM 的定量限均能達到amol 級; 而在酵母基質中,PRM 的定量限仍保持在amol 級,但SRM 的定量限只有fmol 級,上升了一個數量級(圖5A),SRM 離子對受到很大的基質干擾(圖5B)。Gallien 等[42] 使用SRM 和PRM 考察了35 條重標肽段的175 對離子對在尿液基質中的最低定量限,結果表明,只有19% 的離子對其SRM 定量限低于PRM 定量限。近來,PRM 逐漸應用到生命科學研究中,Tsuchiya 等[43] 對野生型和UFD4 基因(泛素融合降解通路)敲除型細胞中脯氨酸-茁-半乳糖苷酶(Ub-茁-bgal)的泛素化進行PRM 監測和定量分析,研究兩種細胞中泛素鏈與蛋白連接位點的變化,證明了UFD4 與K29 型連接的泛素化密切相關。Tang 等[44] 利用PRM 驗證了組蛋白H3 和H4 的甲基化、乙酰化、丙酰化等55 種修飾位點,并對修飾程度進行了定量分析,還發現了H3 K18 甲基化、H4 K20 乙酰化等諸多全新修飾位點。
圖4選擇反應監測SRM(A)與平行反應監測PRM(B)原理[40]
Fig. 4Principle of selected reaction monitoring (SRM)
and parallel reaction monitoring (PRM) [40
圖5SRM/ PRM 靈敏度與選擇性比較[40] :(A) 多種肽段在無基質和酵母基質中的定量限比較; (B) 酵母基質
中肽段GVSAFSTWEk 的提取離子流圖比較
Fig. 5Comparison of sensitivity and selectivity of SRM/ PRM [40] : (A) Comparison of LOQs of peptides in neat and yeast matrix. (B) Comparison of extracted ion chromatograms of peptide GVSAFSTWEk in yeast matrix