定量PCR儀主要由兩部分組成,一個是PCR系統,一個是熒光檢測系統。選擇定量PCR儀的關鍵——由于定量PCR必需借助樣本和標準品之間的對比來實現定量的,對于定量PCR系統來說,重要的參數除了傳統PCR的溫控精確性、升降溫速度等等,更重要的還在于樣品孔之間的均一性,以避免微小的差別被指數級放大。
至于熒光檢測系統,多色多通道檢測是當今的主流趨勢——儀器的激發通道越多,儀器適用的熒光素種類越多,儀器適用范圍就越寬;多通道指可同時檢測一個樣品中的多種熒光,儀器就可以同時檢測單管內多模版或者內標+樣品,通道越多,儀器適用范圍越寬、性能就更強大。
熒光檢測系統主要包括激發光源和檢測器。激發光源有鹵鎢燈光源、氬離子激光器、發光二極管LED光源,前者可配多色濾光鏡實現不同激發波長,而單色發光二極管LED價格低、能耗少、壽命長,不過因為是單色,需要不同的LED才能更好地實現不同激發波長。
監測系統有超低溫CCD成像系統和PMT光電倍增管,前者可以一次對多點成像,后者靈敏度高但一次只能掃描一個樣品,需要通過逐個掃描實現多樣品檢測,對于大量樣品來說需要較長的時間。定量PCR儀需要考慮的另外一個因素是軟件設計,這一點目前較新型號的儀器都有不錯的配套軟件可以滿足常規使用。
隨著定量PCR技術在臨床診斷、疾病監控、藥物監測、腫瘤研究等領域的越來越廣泛的應用,市面上不同品牌和設計的定量PCR儀也不斷推陳出新,本文著重介紹不同的3類定量PCR儀,各有各精彩。
1、傳統的96孔板式定量PCR儀
傳統的96孔板式定量PCR儀以美國應用生物系統公司ABI為代表。傳統96孔板式定量PCR儀的優點是可容納的樣本量大而且無需特殊耗材,可以采用傳統的96孔板甚至384孔板進行批量的定量反應,但是缺點也顯而易見——溫度均一性不佳——平板固定加熱模塊的PCR溫度控制有邊緣效應——樣品槽上每個孔之間的溫度存在差異——也就是所謂位置效應,
因此標準曲線的反應條件應難以做到與樣本完全一致,樣本和樣本之間的溫度控制也可能存在差異,對于靈敏度極高的定量PCR來說,任何極微小的差異都會以指數級別的規模被放大,不能不說是一種缺憾。
傳統反應板面積大,溫度控制的精確性、升降溫速度也相對較慢,因而反應速度也較慢。96孔板定量PCR儀的熒光檢測分析系統,由于96孔板上樣品孔的位置是固定的,每個樣品孔距離光源和監測器的光程各不相同,有可能對結果產生影響。檢測在試管管底進行,試管底的透光性和厚薄均一性都可能對結果產生影響。MJ和Bio-Red公司的定量PCR儀也屬于這一類。
ABI的7500型熒光定量PCR儀激發光源為鹵鎢燈光源,5色濾光鏡,可同時激發96個樣品,超低溫CCD具備同時多點多色檢測的能力,能夠有效地分辨FAM/SYBR Green I,VIC/JOE,NED/ TAMRA/ Cy3,ROX/Texas Red和Cy5等熒光染料。多色熒光檢測技術為多重定量、SNP分析、基因型分型和帶陽性內對照的陰/陽性分析提供了基礎。
多重定量即在同一反應管內同時對多個目標基因進行定量,可以大大提高精度并節約成本。隨機配置的定量PCR引物和探針設計軟件Primer Express非常有用,“因為到目前為止還沒有其他軟件有能力設計定量PCR所需的TaqMan探針”。
各型號都有實時動態Real-Time和終點讀板Plate Read兩種運行模式。實時動態模式用于定量DNA或RNA拷貝數。可以動態顯示PCR擴增曲線的生成,定量的線性范圍大于9個數量級,區分5000和10000個拷貝的DNA模板可信度達99.7%。
終點讀板模式用于基因型鑒定、點突變檢測和單核苷酸多態性SNP分析等。當然,也可以作為普通PCR儀使用。ABI定量PCR儀最大的優勢在于ABI已經發布十二萬種Taqman Gene Expression Assays 人、大鼠、小鼠基因組基因表達分析試劑盒,覆蓋人類全部4萬個基因,二百萬種Taqman Validated SNP Genotyping Assays 人、大鼠、小鼠基因組SNP檢測試劑盒,為運用7000、7300、7500、7900型開展課題研究創造了絕佳的條件。
ABI 的定量PCR儀均支持兩種定量化學:TaqMan熒光探針和SYBR Green I熒光染料。其熔解曲線Dissociation Curve功能用于判斷PCR擴增反應是否特異,有無雜帶生成。
7500型號比7300多一個濾光鏡,新的光路設計使長波長紅色熒光的檢測靈敏度大大提高,帶有快速運行模式。增強的7900型在96孔模塊的基礎上更加可以更換384孔版模塊,使得高通量處理數據的能力大大增強,應該更適合經常處理大量標本的實驗室。