定量PCR技術

  定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技術有廣義概念和狹義概念。廣義概念的定量PCR技術是指以外參或內參為標準，通過對PCR終產物的分析或PCR過程的監測，進行PCR起始模板量的定量。

　　廣義概念下的定量PCR技術可以分為五種類型：

　　（1）外參法+終產物分析。所謂“外參法”是指樣本與陽性參照在兩個反應容器內反應。這種類型沒有對樣本進行質控監測，易出現假陰假陽結果，沒有監測擴增效率，定量不準。

　　（2）內參法+終產物分析。所謂“內參法”是指樣本與陽性參照在一個反應容器內反應。這種類型對樣本進行質控監測，排除假陰結果，但是定量不準。

　　（3）外標法+過程監測。這種類型監測擴增效率，陽性樣本定量準，但是無法排除假陰結果。

　　（4）內參法+過程監測。由于樣本與陽性參照在一個容器內反應，用同樣的Taq酶和反應參與物，存在竟爭性抑制，起始模板量濃度高的反應會抑制起始模板量濃度低的反應，所以定量不準。

　　（5）外標法+過程監測+內對照。這種類型監測擴增效率，陽性樣本定量準，同時排除假陰結果。這種類型是應該提倡的。PCR過程的監測有多種檢測模式。最常用的有三種檢測模式：

　　a.R Green I 檢測模式。溫度循環為94—55—72°C三步法，只有引物，無探針，熒光染料鑲嵌在雙股螺旋鏈中間。通過對特定方向的強熒光檢測獲得信號，這種試劑檢測模式易產生非特異信號，且本底光較大。

　　b.解探針模式（Taqman）Hydrolysis Probe 。溫度循環為94—60°C二步法，不僅有引物，還有另外一個特異針對擴增模板的探針在引物對之間。在探針相鄰兩個堿基上分別結合兩個熒光染料，一個染料接受激發光得到的能量傳給了第二個染料，接受能量的第二個染料通過發射特征光子回到穩定態。當Taq酶在60°C延伸擴增鏈時，遇到探針，利用Taq酶5`—3`外切酶活性將探針水解成單個堿基，單個堿基之間距離較遠，第一個染料的能量無法傳給第二個染料，只好通過發射特征光子回到穩定態，通過對溶液中第一個染料的熒光檢測獲得信號。這種試劑檢測模式增加了檢測信號的特異性，但是由于利用了Taq酶5`—3`外切酶活性，一般試劑廠家只給Taq酶的聚合酶活性定標，沒有同時給Taq酶5`—3`外切酶活性定標，不同批號試劑之間會給定量帶來差異。另外對探針的熔點溫度（Tm）僅要求其高于60°C，這就使不同試劑盒之間的特異性參差不齊，而且無法做質控檢測。

　　c.雜交探針（Hybridization Probes）模式。溫度循環為94—55—72°C三步法，有引物，二個特異針對擴增模板相鄰的探針在引物對之間，在一個探針3`堿基上結合一個熒光染料，在另一個探針5`堿基上結合第二個熒光染料。在55°C時，兩個探針都剛好接合在模板上，第一個染料接受激發光得到的能量傳給了第二個染料，接受能量的第二個染料通過發射特征光子回到穩定態，通過對結合在擴增模板上雙探針中第二個染料的熒光檢測獲得信號。這種試劑檢測模式中熒光信號與特定雜交溫度相關，探針的濃度始終保持不變，因此可以在擴增后檢測熔解曲線作為信號的特異性質控。另外這種試劑檢測模式可以用于點突變檢測。

　　狹義概念的定量PCR技術（嚴格意義的定量PCR技術）是指用外標法（熒光雜交探針保證特異性）通過監測PCR過程（監測擴增效率）達到精確定量起始模板數的目的，同時以內對照有效排除假陰性結果(擴增效率為零)。在國家沒有出臺陰陽判定標準時，所用PCR系統靈敏度最好達到一個拷貝（一個病毒）。從理論上說，只要有一個拷貝數，樣本就算陽性；一個拷貝數都沒有才算陰性。