第三步：尋找一家信賴的公司合成引物和探針，一般引物合成大家比較熟悉，而且價格也比較便宜（特別是這兩年便宜了許多），而探針則相對來說貴了許多，一般
Taqman探針合成在1000到5000元不等（不同的合成要求價錢不同）——而這只是標記價錢，序列合成基本上和引物合成價錢相似。
第四、五、六步：一般的定量PCR反應體系與普通PCR其實也差不了多少，只是要加入Taqman探針，另外不同就是分步法的不同。其中需要注意的是：
* 擴增酶最好選用熱啟動酶
* 引物和探針的濃度需要進行優化，有人建議從50nM開始，在50nM—900nM之間優化，一般為200nM（注意探針需要避光保存。
* 同樣Mg+和酶量也需要進行優化，酶的推薦反應濃度是1.25-1.5U（50ul）
* DNA模板的添加量通常在100
ng以下，因不同種類的DNA模板中含有的靶基因的拷貝數不同，必要時可進行梯度稀釋，確定最佳的DNA模板添加量。如果欲進行2 Step
RT-PCR反應的第二步PCR擴增反應，第一步的RT反應液作為DNA模板時的添加量不要超過PCR反應液總體積的10%。
另外循環參數雖然在引物和探針設計完之后也就確定了，但是有時也需要進行優化。
第七步：在進行數據分析的時候，通常用不同濃度的標準樣品的Ct值來產生標準曲線，然后計算相對方程式。方程式的斜
度可以用來檢查PCR的效率，對于100%PCR效率來說，一個理想的斜率是3.32。最佳的標準曲線是建立在PCR的擴增效率為90%-100
%(100%意味著在每個循環之后，模板的總數將增加為前一次的2倍)的基礎上。所有標準曲線的線性回歸分析需要存在一個高相關系數(R2≥0.99)
，這樣才能認為實驗的過程和數據是可信的。使用這個方程式我們可以計算出未知樣本的初始模板量。大多數定量PCR儀都有這樣一個軟件，它可以從標準曲線中自動地計算出未知樣本的初始模板量。
這其中有兩種基本的方法：絕對定量和相對定量，研究人員需要根據自己的實驗目的來選擇。絕對定量是指將未知樣品與標準曲線相比較進行分析，一般標準品就是一個已知絕對濃度的DNA樣品，要注意得是絕對定量分析的準確性是相對標準品的準確性而言的。相對定量是指兩個或更多的基因互相進行比較，其結果是一個比率，沒有確切的數字被檢測道。
另外由于不同的樣品在反應過程中存在著一定的差異，因此除了要制作標準曲線來進行定量外，還需要設計表達水平相對較為穩定的內參基因來對結果進行標準化。β-actin
和三磷酸甘油醛脫氫酶( Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ，GAPDH)
是兩種較常用的管家基因，另外還有cyclophilin，18sr RNA
，phosphoglyserokinase，beta-microglobulin，beta-glucronidase，hypoxanthine
ribosyl transferase，transferring receptor
等。要注意這些基因可以被反應條件所影響，在設計定量表達研究時，保證初始對照基因的質量是必要的一步，而且嚴謹的研究人員會通過對一系列內參基因定量結果取幾何平均數來對定量數據進行標準化。
還有一個問題就是如何判斷所得到數據的好壞，關于擴增曲線，經驗總結認為：
“1. 總體看曲線拐點清楚，指數期明顯，擴增曲線整體平行性極好，基線平無上揚現象，低濃度樣本擴增曲線指數期明顯。
2. 曲線指數期斜率，反應了擴增效率，越大說明擴增效率越高。擴增效率越高，試劑靈敏度表現會越好。
3. 基線，圖上的基線也就是陰性樣本的擴增曲線，平直或略微下降是好試劑的表現，陰陽性清楚，不易誤判。如果有上揚趨勢，有可能造成陰性標本誤判。
4. 曲線與曲線間平行性非常好，說明各反應管擴增效率相近，外標準定量建立在每管擴增效率一樣的假定基礎上，所以擴增效率越相近，定量的重復性和準確性就越好。而擴增效率相近與否，反應在擴增曲線圖上就是曲線的平行性。
5. 低濃度曲線指數期明顯，一方面不易出現假陰陽性誤判，另一方面說明靈敏度高。”