實時定量PCR技術綜述（原理、熒光標記、TaqManProbes和...1

一．實時定量PCR基本原理
1.PCR反應動力學
右圖為PCR反應曲線（橫坐標為循環數，縱坐標表征產物量），不同的曲線代表初始模板量不同的 PCR反應。PCR反應的動力學公式為：
Cn=C0(1+E)n
其中C0和Cn分別為初始模板和n循環的拷貝數，n為循環數，E為擴增效率（0≤E≤1），理想狀態下（即每個循環中所有模板均與引物結合并等到擴增），E為1。
由上圖可知，只有在線性區段E值才為定值，這樣才能通過檢測Cn定量C0，由于終點檢測不能保證在線性區段，所以重復性不好，實時檢測（每個循環檢測一次）技術解決了這個問題。
2.定量PCR原理

定量PCR是將待測標本與一系列濃度（C0）已知的標準品在同一條件下共同擴增，并進行實時檢測，根據標準品的檢測值及已知的C0值作出標準曲線，如右圖（橫作標為的C0對數值），再根據待測標本的檢測值在標準曲線上查到待測標本的C0值。
3.信號產生
目前定量PCR技術信號產生都是基于 FRET (fluorescence resonance energy transfer)的原理，即在一定波長的光激發下，一個熒光基團A發光，并且被鄰近的另一個熒光基團B吸收，使熒光基團B發光。如檢測熒光基團A，應在FRET消除后；如檢測B，則應在FRET發生時檢測。
根據信號產生方式的不同可將定量PCR技術分為三類：TaqMan Probes技術；Hybridization Probes技術；Molecular Beacons技術。
TaqMan Probes技術（右圖A）是Perkin
Elmer公司1995年研制，利用熱穩定DNA聚合酶5’→3’外切酶活性，將TaqMan 探針 5’端熒光基團切去，使之與3’端熒光基團分離、熒光淬滅消失，在特定波長下檢測5’端熒光基團即可表征PCR產物的量。
Hybridization Probes技術（右圖B）是Roche公司建立的，PCR反應退火過程中，兩個探針與模板雜交（相鄰一個堿基），發生FRET，這時檢測第二個熒光基團即可表征PCR產物的量。Hybridization Probes技術要求熱穩定DNA 聚合酶不具備5’→3’外切酶活性，而是在引物延伸過程中被取代，使探針可在下一循環再與模板雜交，如探針被降解，可導致定量不準。

Molecular Beacons技術（上圖C）利用莖環結構的探針，當形成莖環結構時，發生熒光淬滅，退火過程中，探針與模板雜交，熒光淬滅消失，在特定波長下檢測5’端熒光基團即可表征PCR產物的量。

二.熒光標記
1.TaqMan Probes
TaqMan探針通常在5’端以熒光基團FAM標記，靠近 3’端以熒光基團TAMRA標記，3’端磷酸化以防止探針在PCR擴增過程中被延伸。下表列出了兩種熒光基團的吸收及發射波長。

2.Hybridization Probes
Hybridization探針技術中，上游donor Probe 3’端以熒光基團Fluorescein標記；下游acceptor Probe 5’端以Roche的LC-Red 640標記（當用雙熒光基團時還可同時使用LC-Red 705），3’端磷酸化以防止探針在PCR擴增過程中被延伸。也有文獻報道acceptor Probe 5’端以Cy5標記，下表列出了各種熒光基團的吸收及發射波長。

3.熒光標記基團與 PCR儀的激發與檢測波長
由于熒光標記基團的選擇還受到定量 PCR儀所提供的激發和檢測波長的制約，所以這里介紹一下臨床應用中主流機型所提供的檢測波長，見下表。

三.TaqMan Probes技術要點

TaqMan Probes技術要求所用的熱穩定DNA聚合酶不但要具有5’→3’外切酶活性,而且要求所獲得的擴增曲線符合PCR反應動力學。
Matthew J.Longley等（1990）研究了熱穩定DNA聚合酶的5’→3’外切酶活性,認為：（１）其5’→3’外切酶活性和DNA聚合酶活性位于同一肽段；（２）5’→3’外切酶活性依賴于雙鏈DNA（如右圖）；（３）5’→3’外切酶活性具有熱穩定性，之所以70℃較50℃活性低（如右圖）是由于高溫破壞了探針與模板間的雙鏈結構。
K-A.Kreuzer等（2000）研究了15種熱穩定DNA聚合酶（商品）的5’→3’外切酶活性，其中7種聲稱具有5’→3’外切酶活性，右圖是這７種酶的定量PCR反應（TaqMan）曲線,其中部分酶沒有5’→3’外切酶活性、部分酶具有較弱的5’→3’ 外切酶活性、只有一種酶的擴增曲線（A）符合PCR反應動力學。