實時定量PCR技術綜述（原理、熒光標記、TaqManProbes和...2

下表列出了部分文獻報道的TaqMan Probes技術所使用的酶和其它相關參數。

四.Hybridization Probes技術要點
Hybridization探針技術要求所用的熱穩定 DNA聚合酶沒有5’→3’外切酶活性,以保證探針有恒定的濃度并能反復與模板雜交。
Jochen,Wilhelm等（2001）研究了Taq酶 5’→3’外切酶活性對基于Hybridization探針技術的定量PCR的影響，認為：（１）Taq酶5’→3’外切酶活性降解了部分探針；（２）Taq酶的stoffel片段（去除N端289個 氨基酸）不具有5’→3’外切酶活性，其在高濃度Mg²⁺存在下，能獲得較好的PCR動力學曲線（如下圖）；（３）stoffel片段因高Mg²⁺濃度造成的非特異性擴增可采用加入TaqStart antibody的方式消除。

五.TaqMan 探針與Hybridization探針技術的比較
1. Hybridization探針技術的特異性高于TaqMan探針，因其信號的產生依賴于兩個獨立探針的特異性。但其在探針設計上需要更多的可選序列；

2. TaqMan探針技術的開放性優于Hybridization探針技術，原因有二：（１）TaqMan探針技術的熒光標記系統是開放的，易從第三方獲得，而Hybridization探針的熒光染料為羅氏專有，易受其控制；（２）TaqMan探針和Hybridization探針分別在ABI Prism7700和羅氏LightCycler上建立，因熒光標記和儀器檢測波長的不同，限制了其在兩種儀器上的通用性，目前已有文獻報道將 TaqMan探針用在LightCycler上，但未見報道Hybridization探針用在ABI Prism7700上，可能是ABI Prism7700價格較貴，不適合臨床應用，而ABI GeneAmp 5700SDS只有一個檢測波長（530nm）；也可能Hybridization探針依賴于LightCycler的快速擴增。
3. Hybridization 探針分別標記兩個探針，和TaqMan探針的同一探針三種修飾相比，修飾技術要求低，對修飾的質量控制更有利。