所謂的實時熒光定量 PCR 就是通過對 PCR 擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量 PCR 反應中，引入了一種熒光化學物質，隨著 PCR 反應的進行，PCR 反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線。
RT-qPCR是由三個步驟組成：
1、反轉錄:依賴反轉錄酶將RNA反轉錄成cDNDA;
2、擴增:用PCR的方法擴增cDNA;
3、檢測:實時檢測和定量擴增的產物.
RT-qRCR影響分析可靠性關鍵點(Key porint)：
1、分析結果依賴于模板的數量、質量以及合理的檢測方法設計
2、反轉錄反應的非標準化影響試驗的穩定性
3、數據分析應該高度客觀，如果不合理的分析，從分析結果中會得到混淆的錯誤結果，因此通過對RT-qPCR的每一組分進行質量評價以達到最小化變異性，最大化可重復性，而且還需要沿用一個通用的數據分析的指南。對基因表達分析的標準化的需要是與人類臨床診斷分析相適應的。
存在的問題
由于各個學術團體和科研機構使用不同的操作流程，必然導致大家使用不同定量的來源物以及數據分析：
1、新鮮、冰凍、甲醛固定的樣品
2、整個組織樣本，顯微切割樣本，單個細胞，組培細胞
3、總RNA或者mRNA
4、RNA反轉錄成cDNA的不同的引發策略
5、不同的酶以及酶的不同組合
6、變異系數、靈敏度
7、多類型的檢測化學方法，反應的條件，熱循環儀的分析以及匯報方式。
8、每一步驟缺乏標準化分析流程造成了在樣品的處理，內參的使用，歸一化的方法，質量控制等等因素嚴重影響RT-qPCR的可信度，重復性。
實時定量PCR數據分析
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RNA 質量評價
現在RNA 定量的程序很多。最近EMBO qPCR course (http://www-db.embl.de/jss/EmblGroupsOrg/conf_28) 比較了用Ribogreen, Agilent BioAnalyser, spectrophotometer,Nanodrop and the BioRad Experion 來定量同樣的樣品。結果顯示沒有哪兩種方法得到同樣的分析數據。所以用不同的方法進行定量是不明智的。因此，我們需要用統一套定量分析方法來完成所有RNA樣品的評價。
RNA 質量
RNA 質量主要包括RNA的純度（沒有蛋白質和DNA的污染）以及完整性。傳統的RNA質量的評價通過分析A260/A280的比值或者對瓊脂糖凝膠電泳rRNA的條帶的分析。Agilent Bioanalyser/BioRad Experion 微流體毛細電泳系統也是一種較新的分析方法。Agilent的2100也是一種十分好的分析RNA質量的方法，它通過分析18S以及28S rRNA的分析圖譜，通過圖譜來反應RNA的量和完整性，其完整性通過完整性系數（RIN）來反應。樣品的RINs在10-4之間。10代表完整的RNA，4代表沒有完整的rRNA帶。
由于以上的方法并非100％準確定反應mRNA的完整性，因為他們只是反應rRNA的量來間接測定mRNA的完整性。這里推薦一種方法：采用GAPDH的3’：5’分析法。
我們使用oligo dT進行逆轉錄，然后對逆轉錄的cDNA用multiplex熒光定量評價。設計三個taqman探針來定量三種相同大小的擴增產物。探針設計的位點分別位于3’;5’以及中部。擴增產物的之間的比值反應RNA的完整性。如果3’;5’的比值在1,反應較高度完整性，如果高于5說明降解。
QRT-PCR 抑制物的組成
QRT-PCR抑制物嚴重減少了PCR的靈敏度以及熱動力學反應,高度的抑制還導致假陰性的結果。抑制物的來源：生物樣品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，鹽離子，尿素，血紅素，heparin以及IgG。
是否有抑制物的評價體系：
1、通過對目的樣品進行梯度稀釋進行PCR擴增效率的檢測
2、通過內部擴增對照來反應樣品處理過程中樣本的情況
3、用細菌檢測臨床樣品的抑制
4、通過標準人工合成的擴增進行RT-PCR來反應目標檢測物的抑制情況