Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,
Washington State University, Pullman, WA 99164.
對于從 90 年代初就開始接觸定量 PCR 的實驗人員來說，他們早已對繁瑣的定量方法習以為常。早期定量 PCR 技術的難點主要在于：（ 1 ）如何確定 PCR 正處于線性擴增范圍內（只有在此范圍內 PCR 產物信號才與初始模板的拷貝數成比例）。（ 2 ）一旦線性擴增范圍確定以后，如何找到一個合適的方法檢測結果。為了保證線性，研究者要擴增一系列梯度稀釋的 cDNA (1) 或者對每個基因的擴增循環數作適當的調整 (2) ；有的研究者加一個競爭性模板 (3) ，有的做限制性的稀釋梯度分析 (4) ，或者加一個 PCR 模擬（ mimic ）反應，即用相似的引物與目標產物共擴增 (5) 。而擴增產 物的檢測通常在跑膠以后通過染料，放射活性或者探針進行檢測。
對于已經開始使用實時定量 PCR 的研究者來說，過去的日子已經一去不復返了。在實時 PCR 中，不再需要擔心擴增的線性和放射性污染，也不再需要跑膠和手工收集數據。現在在 2 到 3 小時之內拿到數據已經不再是夢想。除此之外，實時 PCR 還有其它的一些優點：靈敏度大大提高；可以實現高通量；所有實驗在封閉系統內完成，可變因素大大減少；可以進行多重 PCR 反應，而且不需要后期處理。
PCR 實時檢測技術從誕生到現在已經有五年了，但是其應用在近兩年才開始迅猛增長。在 Medline 數據庫中，用" Taqman "或" real-time and PCR" 作為關鍵詞搜索，在 1996 年有 19 篇文章，在 1997 年有 28 篇文章，在 1998 、 1999 、 2000 年文章數分別達到了 52 、 157 和 409 篇。在這篇文章寫作的同時，在 2001 年已經可以找到 551 篇文章了。許多廠商也正在大力宣傳實時熒光定量 PCR 儀及其相關的技術（包括軟件、探針等），而且在不久的將來，會有更多的產品發布。針對實時定量 PCR 這一熱點領域，我們收集了許多目前用實時定量 PCR 來定量 DNA 或 RNA 的方法，匯編成 9 篇文章，涵蓋了從 mRNA 和病毒 DNA 定量到 DNA 的甲基化和單核甘酸多態性的擴增檢測。
Giulietti 等人描述了通過實時 PCR 對 cytokine 基因表達進行定量的方法。因為這一類基因在免疫的諸多方面都起著非常重要的作用，讀者會發現這篇文章非常有用，特別是文中列出了許多 cytokine 基因和看家基因的引物和探針序列。就象大多數方法一樣，這篇文章描述的定量檢測 cytokine 基因表達的方法可以外推檢測許多不同種類的 mRNA 。同時這篇文章也對實時定量 PCR 做了一個很好的綜述，包括探針的化學原理和儀器介紹。我們推薦這個領域的所有新手應該先讀讀這篇文章。
對于 DNA 或 RNA 的常規定量來說，有兩種定量方法：絕對定量和相對定量。絕對定量檢測模板數的精確拷貝數，通常要用到標準曲線。在 Niesters 的文章里討論了絕對定量用于病毒載量分析的方法。而相對定量能給出樣本間基因表達的差異，比如說經過處理的樣本和未經處理的對照。通常，給出基因表達的相對變化就足夠說明問題了，并不需要給出絕對量的變化。因為不要做標準曲線，基因表達的相對變化分析比絕對定量的方法更省時。對于那些想得到相對表達數據的研究者來說， Livak 和 Schmittgen 文章中的公式對于數據分析是非常有用的。這篇文章描述了 2 - ΔΔ CT 方法的推倒 、假設和 2 - ΔΔ CT 在基因相對表達分析中的實際應用。文章中也討論了 2 - ΔΔ CT 方法的兩種衍生方法，以及數據分析的一些小竅門。包括表格設計等。 Lehmann and Kreipe 等人在他們的 文章中將 2 - ΔΔ CT 方法用于病人標本的定量研究。
cDNA 芯片和差異顯示是兩種最常用的高通量篩選基因表達差異的技術。這兩種技術的缺點在于它們只是定性而非定量分析，因而需要用一個定量的方法確認基因表達的差異，而實時 PCR 就是非常合適的一種手段。 Rajeevan 等人的文章描述了一種利用 SYBR-Green I 通過實時 PCR 檢測產物并進行熔解曲線分析的方法，并用該方法對 cDNA 芯片和差異顯示 PCR 技術的結果進行了確認。將實時 PCR 和高通量方法的結果相互比較就能對這個基因是否真的存在表達差異進行確證。相對于 Taqman 探針而言， SYBR-Green I 更高的靈活性使其被用于高通量篩選出的基因的快速確證。
另一個實時 PCR 方法應用的例子是 DNA 甲基化的檢測。 CG 島內胞嘧啶的甲基化形成 5’- 甲基胞嘧啶被認為和許多人類疾病特別是癌癥有關。 Laird 和他的合作者使用了一種被稱作 Methylight 的技術。 Methylight 是一種基于 Taqman 探針的甲基化特異實時 PCR 技術。在擴增之前， DNA 經重硫酸納處理，未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響。特異的引物和 Taqman 探針被用來區分甲基化和非甲基化的 DNA 。和其它實時 PCR 方法一樣， Methylight 無需電泳，因而提高了反應的靈敏性和通量。這種方法的靈敏性在食道癌病人血液中癌細胞異常甲基化的 DNA 檢測中被證明 （ 6 ） 。
實時 PCR 可以分辨點突變，已經被廣泛應用于遺傳分析。 Sevall 描述了一個直接用實時定量 PCR 區分等位基因的方法。有不同的熒光報告基團標記的 Taqman 探針分別與野生型和突變基因雜交。探針雜交的效率和其后的切除與雜交有關。如果一種染料的熒光信號明顯強于另一種則說明它是一個純合子，如果兩種熒光信號都增加則表明是一個雜合子。實時定量 PCR 的數據被標在 xy 坐標軸上來區分特異的基因型。利用這種方法，能在不到兩個小時內很快對 96 個樣本進行基因分型。
另一個核酸定量的重要應用領域是活體切片檢查。世界各地的病理系都儲存有大量的福爾馬林固定和石蠟包埋的活體切片。過去如何利用這些活體切片存在許多困難，包括抽提核酸（特別是 RNA ），在切片中分離特定組織（如癌癥組織和正常組織）。正如 Lehmann 和 Kreipe 文章中所討論的，激光顯微切片技術結合實時 PCR 技術很大程度上提高了在福爾馬林固定和石蠟包埋的活體切片中進行常規分析的能力。文章討論了各種實驗室不同的固定條件對核酸擴增的影響。讀者會從文中找到許多有用的實驗方法：包括從固定液的組成，最佳的固定條件以及激光輔助顯微解剖技術。同時文章也討論了如何在福爾馬林固定和石蠟包埋的活體切片中進行 DNA 甲基化分析的方法。
實時 PCR 不僅僅增強了我們進行常規定量分析的能力，也提高了我們高通量篩選的能力。一個明顯的例證是實時 PCR 和分子信標的結合正在成為檢測單核苷酸多態性的的新方法。檢測單核苷酸多態性對于研究個體對不同疾病的易感性或者個體對特定的藥物的不同反應有著重要的意義。 Mhlanga 和 Malmber 在文章中，對用分子信標實時檢測 SNP 的技術和方法做了很好的綜述。分子信標是雙標記的熒光探針，由兩個部分組成：一個環狀區與目標序列完全配對，一個自身配對的莖區。在環區和目標序列配對之前，熒光被淬滅基團淬滅。一旦 SNP 的序列信息是已知的，采用這種技術進行高通量的 SNP 檢測將會變的簡單而準確。引物或分子信標設計的方法和原則、反應條件、數據分析在文章中都有詳細的討論。文章中還包括了一個用分子信標檢測雌激素受體的特異性等位基因的例子。
在同一反應中同時檢測多種 PCR 產物（如多重 PCR ）已經有 10 年了。在傳統的多重 PCR 反應中，不同的擴增產物通過在膠中不同的遷移速率進行檢測 (7) 。 Wittwer 等人描述了實時多重 PCR 的方法和應用。這個實驗是在一個快速循環的 PCR 儀的玻璃毛細管中進行的．它只采用了一個熒光探針，而不是兩個熒光探針。多重 PCR 可以通過檢測不同顏色或溫度或者同時檢測顏色和溫度來區分。隨著技術的進步，現在已經能在多重 PCR 反應中同時檢測四種顏色。將溫度和顏色組合，實時 PCR 可以檢測每個反應中高達 12 個的產物。在這篇文章中，多重實時 PCR 被用在了等位基因檢測和突變篩選中。
準確的對動植物或者是人中病毒感染的細胞進行定量無疑是很重要的。這個領域發展非常快，而實時 PCR 在其中扮演了一個很主要的角色。 Niesters 描述了用實時 PCR 定量病毒載量的方法。這篇文章也是討論實時 PCR 是否能用于常規診斷的文章之一。在文章中給出了 DNA 和 RNA 病毒檢測的方法步驟。在這篇文章中也討論了所謂的 NASBA 技術（ nucleic acid sequence-based amplification ），它是一種等溫的 RNA 擴增反應，初始 RNA 被擴增成與模板互補的 RNA ，而分子信標被用來檢測這種 RNA ，這其中沒有任何背景 DNA 的擴增。這種方法對反轉錄病毒的定量特別有用。文章還包括了關于標準曲線和準確性的討論以及不同實驗室在定量病毒載量時是否需要內標的討論。
PCR 技術在 80 年代中期出現后，又有許多技術上的新發展。在實時 PCR 出現之前的所謂定量 PCR ，需要特別的訓練、嚴格的測試和特別準確的加樣。而實時 PCR 的出現使得科學家能用一個相對直接的方法研究許多基本而重要的問題。同時實時 PCR 作為常規診斷的手段雖然還有許多困難需要克服，但已經被確立。實時 PCR 在短時期內迅速崛起，它的諸多優點使得舊的實驗方法被打入冷宮。雖然我們還會記起那些老的實驗方案，但毫無疑問，它們以后再也用不上了。
參考文獻
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