實時熒光定量PCR原理和實驗（一）

無論是對遺傳病(如地中海貧血和血友病)、傳染病(如肝炎和艾滋病)或腫瘤進行基因診斷，還是研究藥物對基因表達水平的影響，或者監控藥物和療法的治療效果，定量PCR技術都可以發揮很大作用。定量PCR技術的最新進展是實時熒光定量。該技術借助于熒光信號來檢測PCR產物，一方面提高了靈敏度，另一方面還可以做到PCR每循環一次就收集一個數據，建立實時擴增曲線，準確地確定CT值，從而根據CT值確定起始DNA拷貝數，做到了真正意義上的DNA定量。這是DNA定量技術的一次飛躍。 



　　根據最終得到的數據不同，定量PCR可以分為相對定量和絕對定量兩種。典型的相對定量如比較經過不同方式處理的兩個樣本中基因表達水平的高低變化，得到的結果是百分比；絕對定量則需要使用標準曲線確定樣本中基因的拷貝數或濃度。根據所使用的技術不同，熒光定量PCR又可以分為TaqMan探針和SYBR Green I熒光染料兩種方法。比較而言，探針雜交技術在原理上更為嚴格，所得數據更為精確；熒光染料技術則成本更為低廉，實驗設計更為簡便。在選擇實驗方案時要根據實驗目的和對數據精度的要求來決定。 



　　定量實驗與定性實驗最大的不同，是要考慮統計學要求并對數據進行嚴格的校正，以消除偶然誤差。因此重復實驗和設立內對照非常重要。由于各種各樣的客觀原因，這一點在實踐中往往被輕視或忽視，需要著重強調。當然，與定性實驗一樣，定量PCR也要設立陰性和陽性對照，以監控試劑和實驗操作方面可能出現的問題。 



　　1為什么終點定量不準確？ 



　　我們都知道理論上PCR是一個指數增長的過程，但是實際的PCR擴增曲線并不是標準的指數曲線，而是S形曲線。這是因為隨著PCR循環的增多，擴增規模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求，PCR的效率越來越低，產物增長的速度就逐漸減緩。當所有的Taq酶都被飽和以后，PCR就進入了平臺期。由于各種環境因素的復雜相互作用，不同的PCR反應體系進入平臺期的時機和平臺期的高低都有很大變化，難以精確控制。所以，即使是重復實驗，各種條件基本一致，最后得到的DNA拷貝數也是完全不一樣的，波動很大（圖1）。 

　　 



　　傳統的定量方法，如溴乙錠染色或放射性核素摻入標記后的光密度掃描等，測定的都是PCR的終產物，而不是起始DNA拷貝數。由于PCR的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系，所以根據最終的PCR產物量不能計算出起始DNA拷貝數。 



　　對于絕大多數實驗，比如甲肝的診斷、藥物療效的監測等，需要測定的都是PCR放大之前標本中的DNA原始拷貝數，經過PCR擴增以后的DNA拷貝數已經不能反映真實情況。在這種情況下，就不能采用終點定量，而要根據CT值確定DNA起始拷貝的數量。 



　　2為什么CT值與起始模板拷貝數成線性關系？ 



　　CT值的定義是PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數增長階段的拐點所對應的循環次數。從圖1的重復實驗中可以直觀地看到，盡管平臺期DNA拷貝數波動很大，CT值卻是相對固定的。如果用不同濃度的DNA作PCR，可以看出DNA濃度越高，CT值越小。DNA濃度每增加1倍，CT值減小1個循環。CT值與模板DNA的起始拷貝數成反比。 



　　這一結論可以從數學上嚴格證明。為使表達式簡便，以下推導忽略PCR效率等細節。如果考慮這些因素，可以在方程上增加修正項。這些修正項的增加并不改變方程的線性性質。 



　　一般地，我們有Rn=RB+XO(1+EX)nRS,也就是說第n次PCR循環時的熒光信號強度(Rn)等于背景信號強度(RB)加上每個分子的熒光強度(即單位熒光強度，RS)與分子數目的乘積。當循環次數n = CT時，則有RT=RB+XO(1+EX)CTRS。兩邊取對數，得log(RT -RB) = logX0 + CTlog(1+ Ex) + logRs。整理此式，CTlog(1+ Ex) = - logX0 + log(RT -RB)–logRs。 

　　所以對于每一個特定的PCR反應來說，EX、RT、RB和RS都是常數，所以CT值與log X0成反比，也就是說，CT值與起始模板拷貝數(X0)的對數成反比，起始DNA濃度每增加1倍，CT值減小1個循環。根據CT值的定量是精確和嚴格的，而傳統的終點定量則比較粗放。 



　　如果讀者有興趣的話，也可以假設PCR的效率(即Ex)為100%，從上式推算出定量PCR標準曲線的最佳斜率和CT值的最佳范圍。 



　　3怎樣確定CT值？ 



　　實驗操作中，CT值定義為在基線上方產生可檢測到的統計學上顯著的熒光發射時所對應的PCR循環次數（圖2）。“基線上方”也就是閾值高度的量化定義是基線范圍內熒光信號強度標準偏差的10倍。閾值所在的橫線與PCR擴增曲線的交點所指的PCR循環次數就是CT值。基線范圍的定義是從第3個循環起到CT值前3個循環止，其終點要根據每次實驗的具體數據調整，一般取第3到第15個循環之間。早于3個循環時，熒光信號很弱，扣除背景后的校正信號往往波動比較大，不是真正的基線高度；而在CT值前3個循環之內，大多數情況下熒光信號已經開始增強，超過了基線高度，都不宜當作基線來處理。　　 




　　顯然，CT值取決于閾值，閾值取決于基線，基線取決于實驗的質量，CT值是一個完全客觀的參數。CT值越小，模板DNA的起始拷貝數越多；CT值越大，模板DNA的起始拷貝數越少。正常的CT值范圍在18-30之間，過大和過小都將影響實驗數據的精度。 



　　4熒光信號和定量數據的歸一化 



　　雖然大多數定量PCR儀都會自動扣除本底，但是仍然需要注意熒光信號強度和定量數據的歸一化校正，以便不同樣本之間的實驗數據可以嚴格地相互比較。 



　　由于加樣操作的誤差、離心管透光性能的差異、熒光激發效率的差異等偶然誤差不可避免，因此儀器收集到的原始信號必須進行歸一化校正，以消除這些因素對定量結果的影響。這種校正可以通過在反應體系中添加額外的熒光染料來實現，一般采用紅色ROX熒光，稱為陽性參比信號。ROX在反應緩沖液中的濃度是固定的，因此其信號的強度與反應體系的總體積和總的熒光激發效率正相關。目標基因和對照基因的信號除以陽性參比信號以后，即Rn = R / RROX，就可以在同樣的起點上進行比較和各種計算。