實時熒光定量PCR檢測及臨床應用

實時熒光定量PCR技術的應用

定量PCR是在定性PCR技術基礎上發展起來的核酸定量技術。實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Appliedbiosystems公司推出，它是一種在PCR反應體系中加入熒光基團，利用對熒光信號積累的實時檢測來監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。該技術不僅實現了對DNA/RNA模板的定量，而且具有靈敏度和特異性高、能實現多重反應、自動化程度高、無污染、實時和準確等特點，目前已廣泛應用于分子生物學研究和醫學研究等領域。

1. 分子生物學研究

⑴ 基因表達研究：細胞因子是一種調節蛋白，它對免疫反應、炎癥反應具有重要的調節作用，包括對淋巴細胞激活、增生、分化、存活和凋亡的調節。這些低分子蛋白由淋巴細胞、單核細胞和內皮細胞所分泌，其量的改變常常與一些疾病，如炎癥反應、自身免疫性疾病、移植排斥反應等有密切的關系。由于所得到組織樣本常常因為太小而不能滿足在蛋白質水平的檢測，另外，通常用的蛋白質檢測方法的靈敏度也難以完成對極微量的蛋白產物的檢測，所以應用PCR檢測細胞因子mRNA表達水平就顯得很有意義。實驗研究表明：定量結腸直腸癌淋巴結的癌抗原mRNA的表達量，可以作為診斷癌癥微轉移的重要依據。

⑵ 單核苷酸多態性(SNP)及突變分析：實時熒光定量PCR一個誘人的應用前景是用于檢測基因突變和基因組的不穩定性。基因突變的檢測基于兩條探針，一條探針橫跨突變位點，另一條為錨定探針，與無突變位點的靶序列雜交，兩條探針用兩種不同的發光基團標記。如靶序列中無突變，探針雜交便會降低雜交體的穩定性，從而降低其熔解溫度(T_m)。這樣便可對突變和多態性進行分析。拉米夫定是有效治療慢性乙型肝炎的抗病毒藥物，但臨床應用中不斷有病毒變異的報道，這些變異可能是治療失敗或病毒對治療無反應的原因。實時熒光定量PCR可以監測乙型肝炎患者服用拉米夫定后體內是否產生耐藥突變病毒。

2. 醫學研究

⑴ 病原體檢測：目前，采用熒光定量PCR檢測技術可以對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、結核分枝桿菌、EB病毒和巨細胞病毒等病原體進行定量測定。與傳統的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡便等優點。

⑵ 產前診斷：到目前為止，人們對遺傳性物質改變引起的遺傳性疾病還無法治療，只能通過產前監測，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發生，如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實時熒光定量PCR檢測其Y性別決定區基因是一種無創傷性的方法，易為孕婦所接受。

⑶ 藥物療效考核：對乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析顯示：病毒量與某些藥物的療效關系。HCV高水平表達，干擾素治療作用不敏感，而HCV低滴度，干擾素作用敏感；在拉米夫定治療過程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，隨后若再度上升或超出以前水平，則提示病毒發生變異。

⑷ 腫瘤基因檢測：盡管腫瘤發病的機理尚未清楚，但相關基因發生突變是致癌性轉變的根本原因已被廣泛接受。癌基因的表達增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出現。實時熒光定量PCR不但能有效地檢測到基因的突變，而且可以準確檢測癌基因的表達量。目前用此方法進行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細胞性白血病WT1基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關的病毒基因等多種基因的表達檢測。隨著與腫瘤相關的新基因的不斷發現，熒光定量PCR技術將會在腫瘤的研究中發揮更大的作用。

定量PCR技術對臨床醫學的意義

定量PCR技術有操作方便、好學易懂、檢測精確、出結果快而可靠等優勢；尤其適合臨床應用和推廣。

核酸是生物大分子，是一切生物的遺傳物質，擔負著生命信息的儲存和傳遞。核酸分為兩種，DNＡ和RNA。DNA分子由兩條螺旋的多核苷酸鏈組成，兩條鏈的堿基通過腺嘌呤（A）―胸腺嘧呤（T），鳥嘌呤（G）―胞嘧呤（C）之間的氫鍵連接在一起。這兩條鏈是互補的。DNA以半保留方式進行復制。

病原體基因擴增常用于檢測及鑒定微生物，評價治療反應和檢測耐藥性突變等。對感染性疾病的評價PCR已證明在許多情況下較傳統方法更為優越，尤其是在鑒定不易培養，生長緩慢或不能培養的病原體時候，PCR可以快速（1~2小時內）提供診斷結果，并能同時分析多種樣品；同時PCR不受藥物治療的干擾，可在治療開始后確定感染原，為用藥提供可靠的參考。

PCR幾乎可以用任何組織或體液，包括新鮮與存檔的手術標本來診斷疾病。DNA是相對穩定的分子，可從木乃伊或冷凍的組織中獲取標本。指數擴增使得PCR具有極高的靈敏性，而獨特的引物使用使其具有高度的特異性，且引物的使用保障了PCR技術不象其他傳統的檢測方法為提高特異性而犧牲靈敏性。

目前PCR應用于臨床主要集中在從病原體和患者基因組中擴增與檢測具有診斷參考價值的DNA片段。

定量PCR技術對臨床應用的實際意義：

一、早期診斷

免疫學主要是抗原抗體反應，應用于臨床通常是在體內產生抗體以后，而許多病原體的抗體產生存在較長的“窗口期”，不利于對疾病的早期診斷；但PCR方法直接檢測病原體的DNA/RNA，能大大縮短“窗口期”。以HCV為例，免疫學檢測的“窗口期”平均長達70天，而熒光PCR可將“窗口期”縮短59天，顯然有利于疾病的早期診斷。

對于乙肝、丙肝和艾滋病患者，目前臨床上最常用的檢測手段就是血清免疫學檢測，也就是檢測患者對病毒侵染機體產生的免疫反應，因此血清學檢測指標可間接反映病毒的感染情況；而DAN/RNA則直接反映病毒本身在機體內的存在情況。隨著檢測水平的不斷提高，人們越來越意識到兩者既相關又不盡相一致，臨床上需要將兩者結合起來對患者進行診斷、治療和預后等判斷。（據2000年9月西安第十次全國病毒性肝炎及肝病學術會議討論修訂«病毒性肝炎防治方案»乙型肝炎診斷標準如下：有下列任何一項陽性，可診斷為現癥HBV感染：1）血清HBsAg陽性；2）血清HBV DNA陽性；3）血清抗-HBcIgM陽性；4）肝內HBcAg陽性，或HBV DNA陽性。丙型肝炎的判斷標準如下：1）急性丙型肝炎診斷 臨床符合急性肝炎，血清或肝內HCV RNA陽性；或抗-HCV陽性，但無其它型肝炎病毒的急性感染標志。2）慢性丙性肝炎診斷 臨床符合慢性肝炎，排除其它型肝炎，血清抗-HCV陽性，或血清和/或肝內HCV RNA陽性），從以上的標準可以看出以PCR方法檢測的病原體核酸的存在已成為臨床診斷的重要的指標。

人體在感染HBV、HCV、HIV等病毒的早期（急性期），首先能在血清或血漿中檢測到的是病毒核酸（DNA/RNA），而相應的病毒抗原抗體常常會在一段時間內無法檢出，在醫學上成為“窗口期”。實際上也就是在該段時間內機體已經感染了病毒，而“兩對半”、HCV抗體、HIV抗體檢測卻無法顯示出陽性結果。而檢測病毒核酸可不同程度的大大縮短“窗口期”，以HCV為例，如果檢測HCV RNA可以幫助臨床醫生提前41―60天發現被感染的狀況（見下表）

因此HBV DNA、HCV RNA、HIVRNA的檢出對于該三種病毒感染的早期診斷和提高輸血安全性及器官移植后預防病毒感染等是十分有意義的。

性病如淋病、非淋病性尿道炎等很大一部分是由淋球菌（NG）、沙眼衣原體（CT）等所引致的，結核桿菌則是結核病的致病菌。這些病原體的檢測在臨床上通常采用鏡檢、培養等方法。鏡檢的方法操作簡便，能較快地提供結果，但是由于方法較為粗造，容易造成假陽性結果，同時靈敏度較低也不能滿足臨床要求；培養方法是以上病原體檢測的“金標準”，但通常培養要求高，例如淋球菌比較嬌嫩，體外常會因為標本運輸不當造成培養陰性結果，結核桿菌的培養中因細胞壁缺陷菌及化療后受到損傷的細菌均可導致培養的失敗；培養方法通常耗費時間，以結核桿菌為例，培養通常需要2-4周才能有菌落生長，十分不利于臨床上的及時診斷和用藥，熒光定量PCR方法具有其它方法不可比擬的高靈敏度，可檢測到被測樣本中一到幾個病原菌的DNA，通常只需要半天時間就可出具報告，可很大程度上彌補以上兩種方法的缺陷。例如引起尖銳濕疣或與宮頸病變有顯著相關的人乳頭瘤病毒（HPV），PCR檢測DNA是其感染的唯一確診手段。

HBV、HCV、HIV等病毒可在血液中相對穩定均勻地分布，因此其在血液中的含量變化可直接反映出病毒復制的多少。而TB主要是經呼吸道傳播，NG、CT等主要是經性傳播，主要集中分布于發病部位，臨床上檢測通常對其好發部位進行局部采樣，TB主要是采集肺部痰液，而NG、CT等主要是采集生殖道分泌物。由于該類標本難以實現采樣量的前后一致，TB還存在間歇性排菌等因素，因此無法實現真正的定量，臨床上要求出具定性報告，以陰性（-）或陽性（+）表示是否有對應的病原體。

二．藥物療效觀察

對病原體的藥物治療中，免疫學指標的變化通常比較滯后出現，且受個體差異影響較大，從而對臨床判斷難以及時地提供直接證據；而熒光定量PCR檢測可直接反映病原體滴度是否受藥物治療發生變化，從而為藥物療效觀察提供直接的依據，以供治療方案參考；同時藥物治療中可能引起的基因變異等情況更依賴核酸檢測提供的直接證據。

三．病情判斷和預后評價

評估受侵器官或組織的炎癥發生程度以及是否發生病變；長時間機體病毒高水平的患者尤其是慢性病患者往往預后不好。因此對病原體的定量PCR檢測對病情和預后評估均有參考意義。

四．加快疾病的診斷

許多病原體到目前為止仍舊依靠傳統的細菌培養作為診斷手段，操作繁瑣費時。以結核桿菌為例，傳統培養法需要1~2個月，而熒光PCR可將檢測時間縮短至半天，能更及時地為臨床提供診斷依據。

五．疾病的發病監控

許多病原體尤其是病毒病原體可以在感染人體后整合入細胞基因組內而成為整合型，而一旦機體的免疫力下降等又重新進入活動期并引致發病，臨床上希望通過檢測病原體基因的數量變化并結合臨床表現找出其活動以及是否引起發病的規律。熒光定量PCR可以為此提供直接證據。

六．遺傳疾病的診斷

熒光PCR可以實現對點突變、缺失突變、插入突變、多基因突變等的檢測。對產前診斷具有其它方法不可比擬的優勢，有利于優生優育，提高人口素質。