實用哺乳動物細胞培養手冊（六）

緩沖系統

大多數細胞所需 pH 在 7.2 - 7.4。但是，細胞培養最適 pH 值隨培養的細胞種類不同而 不同。成纖維細胞喜歡較高 pH (7.4 - 7.7), 而傳代轉化細胞系則需要偏酸 pH (7.0 - 7.4)。 由于多數培養液靠碳酸氫鈉（NaHCO3）與 CO2 體系進行緩沖，因此，氣相中的 CO2 濃度 應與培養液中碳酸氫鈉濃度相平衡。如果氣相或培養箱空氣中 CO2 濃度設定在 5％，培養液中 NaHCO3 的加入量為 1.97g/L；如果 CO2 濃度維持在 10％，培養液中 NaHCO3 的加入量為 3.95g/L。細胞培養瓶蓋不應擰得太緊，以保證氣體交換。

HEPES 是一種非離子緩沖液，在 pH 7.2 - 7.4 范圍內具有較好的緩沖能力，但是非 常昂貴，在高濃度時對一些細胞可能有毒。HEPES 緩沖液可與低水平的碳酸鈉（0.34g/L） 共用，以抵消因額外加入 HEPES 引起的滲透壓增加。在這種培養條件下，細胞培養瓶的 蓋子應擰緊，以防止培養液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。大多數培養液中含有酚紅作 為 pH 指示劑，酸性培養液呈橙黃色，堿性培養液呈深紅色。

維生素

在細胞培養中，盡管血清是維生素重要來源， 但是許多培養基中添加了各種維生素以 適合更多的細胞系生長。

其它成分

在一些較為復雜的培養液中還包括其它一些成分。如在雜交瘤技術中常用的 DMEM 培 養液，使用時還需要補加丙酮酸鈉和 2-巰基乙醇（2-Mercaptoethanol，2-Me）。2-Me 對細 胞生長有很重要的作用。有人認為它相當于胎牛血清，有直接刺激細胞增殖作用。2-Me 的活性部分是硫氫基，其中一個重要作用是使血清中含硫的化合物還原成谷胱甘肽，能誘 導細胞的增殖，為非特異性的激活作用。同時避免過氧化物對培養細胞的損害。另一個重 要作用是促進分裂原的反應和 DNA 合成，增加植物凝集素(PHA)對淋巴細胞的轉化作用， 已廣泛應用于雜交瘤技術，另外，也開始用于一些難以培養的細胞。2-Me 是一種小分子 還原劑，極易氧化。分子量為 78.13，純的 2-Me 是一種無色有刺激味的液體，比重為1.110-1.120(Do20)，常用終濃度為 5×10-5M。常配制成 0.1M 的儲存液，用時每升培養液 加 0.5ml。

液體培養基保存：

液體培養基應于 4℃冰箱避光保存，實驗前放入 37℃預熱。未加血清液體培養基有 效期為 12 個月。液體培養基中的 L-谷氨酰胺會隨著儲存時間的延長而慢慢分解。如果 細胞生長不良，可以再添加適量 L-谷氨酰胺。

干粉培養基保存：4℃冰箱避光保存，有效期 36 個月。

血清

細胞培養液中添加的血清有牛血清、馬血清、人血清等，其中牛血清是最常用的血清， 分為胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是從母牛破腹取出的胎牛中分離出的血清，價格 昂貴。新生小牛血清是從剛出生的尚未哺乳的小牛中分離出來的血清，如廠家能做到這一 點，新生小牛血清的質量與胎牛血清的質量相差不大。如小牛出生后已哺乳，從這種小牛 中取出的血清中可能含有較多的生物活性物質，其質量明顯不如前兩種。

血清的質量，種類及使用的濃度都有可能影響細胞的生長，而不同批次的血清支持細 胞生長的能力也不同，尤其是對克隆細胞的生長，某些批次血清可能含有毒性或抑制細胞 生長的物質。因此，在購買大量血清之前，必須對血清支持細胞生長能力進行檢測，然后再，然后大量購買質量好的同一批號的血清，并注意以下幾點：

（1）需要長期保存的血清必須儲存于-20℃ – 70℃ 低溫冰箱中。4℃冰箱中保存時間切 勿超過 1 個月。由于血清結冰時體積會增加約 10％，因此，血清在凍入低溫冰箱前， 必須預留一定體積空間，否則易發生污染或玻璃瓶凍裂。

（2）一般廠商提供的血清為無菌，無需再過濾除菌。如發現血清有懸浮物，則可將血清 加入培養液內一起過濾，切勿直接過濾血清。

（3）瓶裝血清解凍需采用逐步解凍法：-20℃ 至 -70℃ 低溫冰箱中的血清放入 4℃冰箱 中溶解 1 天。然后移入室溫，待全部溶解后再分裝。在溶解過程中需不斷輕輕搖晃均 勻（小心勿造成氣泡），使溫度與成分均一，減少沉淀的發生。切勿直接將血清從-20℃進入 37℃解凍，這樣因溫度改變太大，容易造成蛋白質凝集而出現沉淀。

（4）熱滅活是指 56℃, 30 分鐘加熱已完全解凍的血清。加熱過程中須規則搖晃均勻。此 熱處理的目的是使血清中的補體成分（complement）滅活。除非必須，一般不建議作 此熱處理，因為熱處理會造成血清沉淀物顯著增多，而且還會影響血清的質量。補體 參與反應有：細胞毒作用, 平滑肌細胞收縮, 肥大細胞和血小板釋放組胺, 增強吞噬 作用, 促進淋巴細胞和巨噬細胞發生化學趨化和活化。

（5）切勿將血清在 37℃放置太久，否則血清會變得渾濁，同時血清中的有效成分會破會 而影響血清質量。

（6）血清中的沉淀物 絮狀物：主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質量。可用離心 3000rpm, 5 分鐘去除，也可不用處理。

顯微鏡下“小黑點”：經過熱處理過的血清，沉淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物 在顯微鏡下觀察象“小黑點”，常誤認為血清受污染。一般情況下，此小黑點不會影 響細胞生長，但如果懷疑血清質量，則應立即停止使用，更換另一批號的血清。