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  • 發布時間:2020-04-28 23:55 原文鏈接: 實用哺乳動物細胞培養手冊(六)

    緩沖系統

    大多數細胞所需 pH 在 7.2 - 7.4。但是,細胞培養最適 pH 值隨培養的細胞種類不同而 不同。成纖維細胞喜歡較高 pH (7.4 - 7.7), 而傳代轉化細胞系則需要偏酸 pH (7.0 - 7.4)。 由于多數培養液靠碳酸氫鈉(NaHCO3)與 CO2 體系進行緩沖,因此,氣相中的 CO2 濃度 應與培養液中碳酸氫鈉濃度相平衡。如果氣相或培養箱空氣中 CO2 濃度設定在 5%,培養液中 NaHCO3 的加入量為 1.97g/L;如果 CO2 濃度維持在 10%,培養液中 NaHCO3 的加入量為 3.95g/L。細胞培養瓶蓋不應擰得太緊,以保證氣體交換。

    HEPES 是一種非離子緩沖液,在 pH 7.2 - 7.4 范圍內具有較好的緩沖能力,但是非 常昂貴,在高濃度時對一些細胞可能有毒。HEPES 緩沖液可與低水平的碳酸鈉(0.34g/L) 共用,以抵消因額外加入 HEPES 引起的滲透壓增加。在這種培養條件下,細胞培養瓶的 蓋子應擰緊,以防止培養液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。大多數培養液中含有酚紅作 為 pH 指示劑,酸性培養液呈橙黃色,堿性培養液呈深紅色。

    維生素

    在細胞培養中,盡管血清是維生素重要來源, 但是許多培養基中添加了各種維生素以 適合更多的細胞系生長。

    其它成分

    在一些較為復雜的培養液中還包括其它一些成分。如在雜交瘤技術中常用的 DMEM 培 養液,使用時還需要補加丙酮酸鈉和 2-巰基乙醇(2-Mercaptoethanol,2-Me)。2-Me 對細 胞生長有很重要的作用。有人認為它相當于胎牛血清,有直接刺激細胞增殖作用。2-Me 的活性部分是硫氫基,其中一個重要作用是使血清中含硫的化合物還原成谷胱甘肽,能誘 導細胞的增殖,為非特異性的激活作用。同時避免過氧化物對培養細胞的損害。另一個重 要作用是促進分裂原的反應和 DNA 合成,增加植物凝集素(PHA)對淋巴細胞的轉化作用, 已廣泛應用于雜交瘤技術,另外,也開始用于一些難以培養的細胞。2-Me 是一種小分子 還原劑,極易氧化。分子量為 78.13,純的 2-Me 是一種無色有刺激味的液體,比重為1.110-1.120(Do20),常用終濃度為 5×10-5M。常配制成 0.1M 的儲存液,用時每升培養液 加 0.5ml。

    液體培養基保存:

    液體培養基應于 4℃冰箱避光保存,實驗前放入 37℃預熱。未加血清液體培養基有 效期為 12 個月。液體培養基中的 L-谷氨酰胺會隨著儲存時間的延長而慢慢分解。如果 細胞生長不良,可以再添加適量 L-谷氨酰胺。

    干粉培養基保存:4℃冰箱避光保存,有效期 36 個月。

    血清

    細胞培養液中添加的血清有牛血清、馬血清、人血清等,其中牛血清是最常用的血清, 分為胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是從母牛破腹取出的胎牛中分離出的血清,價格 昂貴。新生小牛血清是從剛出生的尚未哺乳的小牛中分離出來的血清,如廠家能做到這一 點,新生小牛血清的質量與胎牛血清的質量相差不大。如小牛出生后已哺乳,從這種小牛 中取出的血清中可能含有較多的生物活性物質,其質量明顯不如前兩種。

    血清的質量,種類及使用的濃度都有可能影響細胞的生長,而不同批次的血清支持細 胞生長的能力也不同,尤其是對克隆細胞的生長,某些批次血清可能含有毒性或抑制細胞 生長的物質。因此,在購買大量血清之前,必須對血清支持細胞生長能力進行檢測,然后再,然后大量購買質量好的同一批號的血清,并注意以下幾點:

    (1)需要長期保存的血清必須儲存于-20℃ – 70℃ 低溫冰箱中。4℃冰箱中保存時間切 勿超過 1 個月。由于血清結冰時體積會增加約 10%,因此,血清在凍入低溫冰箱前, 必須預留一定體積空間,否則易發生污染或玻璃瓶凍裂。

    (2)一般廠商提供的血清為無菌,無需再過濾除菌。如發現血清有懸浮物,則可將血清 加入培養液內一起過濾,切勿直接過濾血清。

    (3)瓶裝血清解凍需采用逐步解凍法:-20℃ 至 -70℃ 低溫冰箱中的血清放入 4℃冰箱 中溶解 1 天。然后移入室溫,待全部溶解后再分裝。在溶解過程中需不斷輕輕搖晃均 勻(小心勿造成氣泡),使溫度與成分均一,減少沉淀的發生。切勿直接將血清從-20℃進入 37℃解凍,這樣因溫度改變太大,容易造成蛋白質凝集而出現沉淀。

    (4)熱滅活是指 56℃, 30 分鐘加熱已完全解凍的血清。加熱過程中須規則搖晃均勻。此 熱處理的目的是使血清中的補體成分(complement)滅活。除非必須,一般不建議作 此熱處理,因為熱處理會造成血清沉淀物顯著增多,而且還會影響血清的質量。補體 參與反應有:細胞毒作用, 平滑肌細胞收縮, 肥大細胞和血小板釋放組胺, 增強吞噬 作用, 促進淋巴細胞和巨噬細胞發生化學趨化和活化。

    (5)切勿將血清在 37℃放置太久,否則血清會變得渾濁,同時血清中的有效成分會破會 而影響血清質量。

    (6)血清中的沉淀物 絮狀物:主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成,這些絮狀物不會影響血清本身的質量。可用離心 3000rpm, 5 分鐘去除,也可不用處理。

    顯微鏡下“小黑點”:經過熱處理過的血清,沉淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物 在顯微鏡下觀察象“小黑點”,常誤認為血清受污染。一般情況下,此小黑點不會影 響細胞生長,但如果懷疑血清質量,則應立即停止使用,更換另一批號的血清。


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